仪器分析荧光分析法2课件

第十二章荧光分析法fluorometry1概述某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。

2荧光的分类根据物质是分子还是原子：分子荧光

原子荧光

根据照射光的种类：紫外荧光X射线荧光红外荧光方法测定灵敏度10-1010-12g/ml

3S0V=0123S1*S2*VnT1*荧光与磷光产生示意图52.荧光和磷光产生振动弛豫vibrationalrelexation内部能量转换internalconversion荧光发射fluorometry外部能量转换externalconversion体系间跨越intersystemcrossing磷光的产生6（二）激发光谱与发射光谱光源单色器1单色器2检测器excitationspectrum

横坐标ex，纵坐标发射光强度fluorescencespectrum

横坐标em，纵坐标发射光强度7斯托克斯位移’=-’9荧光光谱的形状与激发波长无关不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从s1开始，荧光光谱的形状是一样的。荧光强度(nm)40030050010荧光强度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激发光谱和发射光谱荧光光谱的形状与激发波长无关11求荧光寿命Ft=F0e-t/flnF0Fttf=lnF0Ftt直线斜率为1f13fluorescenceefficiency

(fluorescencequantumyield)f=发射荧光的光子数吸收激发光的光子数14（二）有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构分子的刚性取代基152.分子的刚性同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大，越大，长移。CH2f=0.2f=1.017刚性和共平面性增加电子的共轭程度增加-COO-COO-COO-O荧光素钠酚酞18原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原来共平面性较好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐

19（三）荧光试剂荧光胺Dansyl-Cl邻苯二甲醛(OPA)测定无机离子的荧光试剂21荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应COOHONROH-NH2R-NH2ex275,490nmem480nmOOOO22Dansyl-Cl与伯仲胺及酚羟基反应NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2无水丙酮+HClex365nmem~500nm23无机离子一般本身没有荧光，但与一些有机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光N-OHN-OLi+Li+ex370nmem580nmP235表12-125有些无机阴离子可使荧光熄灭N-OHN-OAl1/3+Al+CN-使荧光熄灭或减弱F-26

荧光熄灭剂的影响荧光熄灭剂quenchingmedium发生碰撞而使之失去能量生成不发光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三线态。荧光熄灭法fluordscencequenchingmethod荧光自熄灭C>1g/l29散射光的干扰scatteringlight光子与物质分子碰撞弹性碰撞非弹性碰撞碰撞双方能量不变光子运动方向改变碰撞过程中发生能量传递，同时光子运动方向发生改变ReyleighscatteringlightRamanscatteringlight30硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光谱Fnm320448350448360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmem448nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmem448nm对测定无影响对测定有影响31在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长32I0IF第三节定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系F=K’(I0-I)I=I010-ECLF=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)33e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)(-2.3ECL)11!+(-2.3ECL)22!F=K’I0[1-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!++…)](-2.3ECL)33!+=K’I0[2.303ECl-(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-…]若C很小，ECl≤0.05则F=2.3K’I0ECl=KC+…34F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05FCECl

>0.05F与C不成正比荧光法紫外法FA=-lgT=-lgI

/I0

荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法35二、定量分析方法标准曲线法比例法多组分分析C1C2C3C4C5100%2060804080%16486432用空白溶液调零用标准溶液调满刻度36比例法（对比法）若在某浓度范围中成线性，可用比例法测定CsCxFsFx=CxFsFx=CsCsCxFs-F0Fx-F0=CxFs-F0Fx-F0=Cs37多组分分析各组分荧光峰不重叠，可分别测定相互重叠，可利用荧光强度的加和性，如：ba12Fa

=KaCa

+KbCb1:Fa’

=Ka’

Ca

+Kb’Cb2:38第四节仪器与荧光分析新技术光源单色器样品池检测器单色器放大器显示器滤光片荧光计滤光片—单色器荧光分光光度计39仪器的校正灵敏度波长激发光谱和荧光光谱40荧光分析新技术简介1.激光荧光分析以激光作光源，谱线更纯、强度更大。可提高灵敏度和专一性。一次测量所需样品液<1g，可测至10-14~10-16g。新技术仪器方面更新化学方法改善412.时间分辨荧光

time-resolvedfluorometry样品杂质脉冲激光10-10s10-12s423.同步荧光分析

synchronousfluorometry若：=em-exF=K’（ex）（em）CFexFemF=K’（ex）（ex+）Cf=f