中国药典无菌检查法课件

2005年版《中国药典》

无菌检查辽宁省药品检验所抗生素室李冰2009.7一、2005年版无菌检查法特点二、无菌检查法概念三、2005年版增、修订内容四、供试品的无菌检查法五、菌种

一、2005年版无菌检查法特点完善检查方法增加试验的可操作性方法更具科学性，提高检出率，保证检验结果的准确性缩小与先进国家药典的无菌检查法的差别三、增、修订内容

无菌检查法的设施及环境、培养基名称、培养基种类及用途、培养基制备及装量、培养基灭菌及贮藏、培养基的适用性检查、试验用菌株、最小检验量、方法验证、培养时间、结果判断

1、无菌检查的设施及环境

⑴试验环境应在洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内或隔离系统中进行、其全过程必须严格遵守无菌操作。

规定应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净级的检测。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

⑵隔离系统的应用

应用隔离系统重要的两方面：一是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求;二是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。

3、培养基的制备、装量培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。4、灭菌所有培养基、稀释液及冲洗液的灭菌程序均应验证，方可采用。防止灭菌不彻底或过渡灭菌

5、培养基的贮存制备好的培养基应在2-25℃、避光保存保存在非密闭容器中，应在3周内使用

(一般指配制的）。保存在密闭容器中，可在1年内使用（一般指商品化的）。⑵灵敏度检查①菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)「CMCC(B)63501」生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candidasporogenes）[CMCC（B）98001]黑曲霉（Asperjillusniger）[CMCC（F）98003]

②菌液制备试验菌培养基培养温度培养时间

（℃）（小时)

金黄色葡萄球菌营养肉汤30-3518-24

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体

白色念珠球菌改良马丁培养基23-2824-48

黑曲霉改良马丁琼脂斜面5-7天

③培养基接种试验菌培养基每管装量接种管数接种量培养时间(ml)(支)（ml）（天）金黄色葡萄球菌硫乙醇酸盐12213铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠球菌改良马丁培养基9215黑曲霉其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有1支不接种作为空白接种量1ml含菌＜100cfu

7、稀释液、冲洗液

0.1%蛋白胨水溶液

PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

如需要可加入表面活性剂或中和剂应经方法验证证明其有效性，并对细菌存活无影响。修改原因：增加检出率，使受损的微生物复苏

8、方法验证试验

在建立供试品的无菌检查方法时，需对供试品的抑细菌和抑真菌特性及无菌检查方法的可靠性进行验证

供试品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证，并对每一株试验菌逐一进行验证。（1）菌种及菌液制备同培养基灵敏度试验方法（2）方法验证方法培养基接种菌加菌量接种管数培养天数（cfu）（支）（天）直接接种法硫乙醇酸盐金黄色葡萄球菌＜10023-5铜绿假单胞菌2生孢梭菌2枯草芽孢杆菌2改良马丁白色念珠菌＜10023-5黑曲霉23-5薄膜过滤法同直接接种法

接种2管中其中1管接规定量的供试品，另1管作为对照

⑵直接接种法

取规定量培养基分别接入小于100cfu的试验菌（6种菌）各2管，其中1管接入规定量供试品，另1管作为对照。培养3～5天。

（3）

结果判断与对照管比较如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。按此法进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。应采取措施，消除供试品的抑菌作用。并再重新进行验证试验

四、供试品的无菌检查法

无菌检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。如供试品允许应优先采用薄膜过滤法.

3.检验数量指一次检验所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外参照表1、2、3采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照；采用直接接种法应增加供试品1支（瓶）作为阳性对照。4.检验量指一次试验所用供试品总量（g/ml）除另有规定外参照表2、3。若每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法的总量，只要供试品的特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤.

5.薄膜过滤法过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般薄膜过滤器。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。⑵可溶水的固体制剂供试品取规定量，按标签说明复溶，根据其溶解性按水溶液或非水溶性制剂项下方法操作。⑶装有药物的注射器供试品按水溶性制剂或非水溶性供试品项下方法操作，针头直接接种。

（4）β-内酰胺类抗生素供试品取规定量，按水溶性制剂或无菌粉针剂及无菌粉末原料的供试品处理法处理，薄膜过滤，用冲洗液冲洗数次。最后一次用适量的β-内酰胺酶冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基；或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶的培养基。

（5）非水溶性的供试品取规定量，直接进行过滤或溶于含适量聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤，用0.1%～1%聚山梨酯80蛋白胨溶液冲洗滤膜至少3次，于含或不含聚山梨酯80培养基中培养。

（6）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品检查方法

取规定量供试品加入适量不超过44℃无菌十四烷酸异丙酯内，剧烈振摇，使供试品充分溶解，趁热过滤（脂膜），或加入100ml稀释液中，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后用适量的冲洗液冲滤膜数次（水膜）。十四烷酸异丙酯的配制

:

采用薄膜过滤法除菌，选用孔径为0.22um的脂溶性滤膜，滤膜在140℃干热灭菌2小时。

（7）无菌气（喷）雾剂供试品取规定量，将样品容器置冰室冷冻约1小时。速以无菌手续在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法检验。（8）具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）取规定量，每个最小包装用50ml～100ml冲洗液分别冲洗内壁，集中冲洗液于适宜的无菌容器中，薄膜过滤。同时应做包装中所配带的针头的无菌检查（直接接种法）。

6.直接接种法

供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。同时硫乙醇酸盐培养基每管装量不得少于15ml、改良马丁培养基每管装量不得少于10ml，培养基用量和高度应经方法学验证。①一般水溶性供试品②混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量接种至培养基中。③固体制剂供试品取规定量直接接种，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至培养基中。④ß-内酰胺类或磺胺类供试品取规定量，混合，加入适量的无菌ß-内酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和，接种至培养基中。或接入含ß-内酰胺酶或对氨基苯甲酸的培养基中。⑤非水溶性供试品取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的培养基中。⑥敷料供试品取规定数量，以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪取约100mg或1cm×3cm的供试品，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。⑦肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装，无菌拆开包装，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。⑧灭菌医用器具供试品取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。⑨放射性药品取供试品1瓶(支)，接种于装量为7.5ml的培养基中。每管接种量为0.2ml。

7.培养及观察

培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长或镜检进行判断。阴性对照不得有菌生长。

8.结果判断若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。

除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：

⑴对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；⑶阴性对照管有菌生长。⑷供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。

表1

批产品出厂最少检验数量供试品批产量N（个）每种培养基最少检验数量注射剂

≤10010%或4个（取较多者）

100＜N≤50010个

＞5002%或20个（取较少者）大体积注射剂＞100ml

2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品

≤2005%或2个（取较多者）

＞20010个桶装固体原料

≤4每个容器

4＜N≤5020%或4个容器（取较大者）

＞502%或10个容器（取较大者）抗生素固体原料药（≥5克）

6瓶(支)医疗器具

≤10010%或4件（取较大者）

100＜N≤50010件

＞5002%或20件（取较少者）

注：若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量应加倍

表2.上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少量（ml）最少检验数量（瓶或支）≤1全量

20①1＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(静脉给药)半量10100≤V≤500半量6V＞50050061.每种培养基各接种10支供试品。

表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M（/支、瓶或个）每支样品接入每管培养基的最少量（mg）最少检验数量（瓶或支）M<50mg全量

20①50mg≤M<300

mg半量10300

mg≤M<5g150

mg10M≥5g500

mg

10②外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm×3cm10缝合线、一次性医用材料整个材料③

20①带导管的一次性医疗器具（如输液袋）

10其它医疗器具整个器具③（切碎或拆散开）

20①注：①.每种培养基各接种10支供试品。

②.抗生素粉针剂（≥5克）及抗生素原料药（≥5克）的最少检验数量为6瓶（或支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。③.如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。五、菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物学特性。应采用适宜的保存技术，防止试验菌株发生变异。

菌种的保存

对微生物实验来说菌种是特殊的标准品应给予相同于化学标准品的管理（溯源性、质量的原始性）外，还有安全性方面的管理。1.

溯源性(菌种的来源)：药品微生物实验室的标准菌种应来自中国药品生物检定所医学菌种保藏中心（ChinaMedicalCultureCollection——CMCC）系列。或美国药典收载的美国菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection——ATCC）系列等国际法定菌种保藏中心。2.菌种的质量控制：对选择性培养基上培养的典型菌落进行鉴定。形态、染色镜检、纯度、必要时应做生化鉴定试验，一旦出现偏差，应做进一步的调查，所有被确认受到污染或变异的菌种应及时销毁，不得用于常规实验用。

3.菌种管的标签要求—名称、编号、代数、有效期、制备日期

菌种记录：名称、编号、来源、菌落形态特征、培养特性、生化与血清学鉴定、传代数、培养基及培养条件、保藏方法、贮存条件及保藏库址。4.菌种保藏方法有多种，但对不同的微生物应通过保藏试验来选择最适宜保藏方法。一般多用琼脂斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、干燥沙土保藏方法、冷冻真空保藏法、甘油冷冻管保藏法等。⑴琼脂斜面低温保藏方法实验室多采用此法一般在4℃保存。铜绿假单孢菌在室温保存。

⑵液体石蜡保藏法本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理、生化水平，延长菌种保藏时间。

方法：液体石蜡121℃高压灭菌30min或110-170℃烘箱1-2h干燥去掉水分。

取经培养的高层半固体菌管加入石蜡，高出培养基面1cm为宜，在4℃保藏。

⑶冷冻真空保藏法保护剂有多种，多用脱脂牛奶。将牛奶煮沸、静止、冷却除去上面一层脂肪，重复3次用脱脂棉过滤，113℃高压灭菌30min，接入菌种，培养后低温、冷冻、真空干燥置-35℃保存。（4）甘油冷冻管保藏法将待保藏菌接种平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌24～48小时的培养物，白色念珠菌72小时的培养物。），用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中加入等体积20％的无菌甘油，轻轻振摇小管，使内容物充分混和，分装于无菌小管，制好的甘油冷冻管最好在－30℃贮存。5、微生物废弃物的灭活

废弃的菌种、菌液、带菌培养基以及带菌器皿须经过高压（121℃）灭菌后方可处理。无菌室管理制度1无菌室的要求1.1无菌室是专门进行药品无菌、微生物限度检查的试验室，不得进行其他试验，无菌检查用无菌室与微生物限度检查用无菌室应各自独立。1.2无菌室由更衣室、缓冲室及操作间组成。1.3无菌室设连锁式传递窗口，以保证人流物流分开。1.4操作间应达到洁净度10，000级，内设无菌净化台，洁净度达到100级。1.5第二更衣室设有洗手盆。1.6各房间设有照明灯，紫外灯。电源开关应设在室外。1.7无菌室应有空气净化除菌的层流系统，保证试验时空气正压。1.8无菌试验时无菌室的温度应控制在18～26℃范围内，相对湿度应控制在60%以下。2无菌室的管理2.1无菌室由专人管理2.2无菌室应每半年检测一次室内的洁净度（尘埃粒子计数仪）并应符合要求，同时做好记录。每一个月检测一次室内的无菌度（平板计数法），应符合要求，同时做好记录。2.3无菌室内仅存放最必须的检验用具，保持固定位置，不随意移动。3无菌室的使用3.1每次试验前应用消毒剂擦拭工作台面及可能污染的死角，开动空气净化系统及紫外灯杀菌20～30分钟。3.2人员进入无菌室须经更衣并洗手后方可进入无菌室。3.3检验样品及培养基等试验物品进入试验室必须通过传递窗，并在传递窗内经紫外灯照射20～30分钟。在操作间内除去物品的外包装后进行试验。3.4根据检测的情况决定是否用丙二醇进行空气消毒，及更换滤器。3.5每次试验后同样须用消毒剂擦拭工作台面，及可能污染的死角，打扫干净台面、地面后继续开动空气净化系统以除去室内的湿