第五章质谱法测定分子结构(二)大分子

有机质谱原理及应用第五章：质谱法测定分子结构(II),大分子1方法：ESI和MALDI两种电离方法。对象：带有官能团的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早报道聚乙烯醇(PEG)，~22,000。1992年，Danis，MALDI，聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，~30,000。

M.Karas&F.HillenkampMALDI，聚苯乙烯~70ku，PEG~40ku。1996年，C.Fenselau，聚苯乙烯~1500ku。§5.1高聚物质谱分析2一、质谱方法分析高聚物的特点1、人工合成高聚物的复杂性合成高分子是混合物，分子量是一种分布。不同的引发和终止反应所得的高分子有不同的端基。在随机共聚物中，高分子链的组成呈现某种化学分布。在嵌段共聚物中存在着不同的嵌段长度和顺序。非线性高分子，如环状、支链和树枝状高聚物。2、质谱分析高聚物的特色样品用量少、耗时短、速度快。仪器分辨率高．使单体分析和端基分析成为可能。直接测定绝对分子量，而不是相对分子量，精度高于光散射和膜渗透方法。测定分子量时，不需要标准品或Mark-Houwink常数。由分子量分布可获得聚合反应的链增长常数。3二、MALDI-TOF方法测定高聚物影响因素1、基质基质的作用：从激光脉冲中吸收能量。要求：基质对激光光源必须有很强的吸收。使被测分子分离成单分子状态。要求：基质和被测高分子具有很好的相容性，同时不能有强的分于间的相互作用。使用不同种类的激光(IR，UV)电离，需要用不同类型的基质。紫外激光解离的基质蒽三酚和银盐的混合是分析聚苯乙烯的首选，但是这个混合物不稳定，见表格。红外激光解离的基质YAG激光(3.27m，相当于3050cm-1)激发C-H的伸缩振动。应用于UV-MALDI的基质也可用于IR-MALDI。4MatricesPolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoicacidPolypropyleneglycol-Cyano-hydroxycinnamicacidPolyvinylacetateFerulicacidPolytetramethyleneglycolIndoleacrylicacidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyrenealltrans-RetinoicacidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic红外激光与紫外激光电离的比较：红外激光有较强的穿透能力，一次红外激光照射能够解吸更多的样品，因此在一个样品点上获得的质谱图较少，要经常更换激光照射点。红外激光的脉冲较长。一般在10～20s，而通常的紫外激光的脉冲约在3～5s，这导致了IR-MALDI的分辨率较差。一般来讲，紫外激光器更适于分析合成高分子，红外激光器可用于一些卤代高分予的分析。基质的选取：极性相似原则！常见基质的极性比较5基质Mr/cm-1(at337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841~866854±14854±16-CHCA1890.79105-841933±9766±8芥子酸(SA)2241.10105-887894±13蒽三酚226-874±8IAA187-900±16HABA242-943766±8UV-MALDI基质的理化性质62、盐效应高分子测定过程中的阳离子化不是质子转移反应，而是金属离子与高分子发生阳离子化反应，形成加合的高分子正离子。一般用Na+、K+等作为加合离子。有时不需要特别加入这些金属，亦可以得到加合的正离子，这是由于容器上的Na+或K+所致。具有杂原子的合成高分子，在加钠盐、钾盐后产生加合金属阳离子的正离子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。没有杂原子的非极性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯在加入银盐或铜盐后能够成功的离子化，这些金属阳离于与高分子中的双键发生了作用。没有杂原子和双键的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍较难被MAIDI分析，因为它们的金属阳离子结合能极低。73、样品制备简单混合法：在使用一个特定的样品制备方法时，必须先选择适用于基质、样品和阳离子化盐的溶剂，最理想的情况是使用一种溶剂．这样可以减少样品在靶上结晶时分层的危险。然而，盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。一般来讲，盐可以先溶于一个中间溶剂．如丙醇中，然后再用用于基质和样品的溶剂稀释。制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。电喷雾法一个很有前途的样品制备方法是电喷雾沉积法，比起传统的干点甚或薄层法，电喷雾法的优点在于它可以形成小而均匀的结晶体。电喷雾沉积法制得样品的点点之间重复性好，并且信号强度较大，层式的电喷雾效果更好一些。压片法对于不溶的高分子样品，如聚氨酯和大的多环芳香化台物，发展了一砷新的制样方法—压片法．即将样品和基质按一定比例混合后用球磨机研磨均匀，压成薄片进行MALDI-TOF-MS分析。8三、MALDI-TOF方法测定高聚物的应用1、分子量的测定及分子量的分布计算公式：当分子量的分散度小于1.2时．可获得符合Poisson分布的质谱图，与GPC的结果一致。Mn：数均分子量Mw：重均分子量PD：分布常数ni：第i个寡聚物的相对丰度Mi：第i个寡聚物的质量PS2800的MALDI-TOF质谱图PEG2000的MALDI-TOF质谱图9PEG3100的MALDI-TOF质谱图PS29ku的MALDI-TOF质谱图聚合物数均分子量Mn重均分子量Mw分子量分布PD测定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法与GPC方法所测分予量的比较102、末端基分析含有联吡啶的共轭高分子结构聚合物的MALDI-TOF质谱(a)IAA为基质,(b)IAA为基质。并加入细AgTFA11高分子化合物3(n=5)，环状寡聚物的实验结果(左)和理论同位素分布(右)(a):[(C28H32N2S)5+H]+(b):[(C28H32N2S)5+Ag]+

选取2142.1u的单同位素峰来计算端基的质量。重复单元的质量是428.2,代入2142.1/428.2＝5，即428.25＝2141。这个峰的质荷比等于5个重复单元加1个质子比时带上的氢原子的质量，因此可以椎测这个系列的高分子为环状高分子．没有端基。1235u+158u+H+237u6=1616u35u+140u+H+237u6=1598u17u+140u+H+237u6=1580un=6一种寡聚物的MALDI-TOF质谱分析两种单体：三嗪聚胺的MALDI-TOF的质谱133、高分子混合物分析用MALDI分析不同种类的高分子混合物的文章很少．也许是因为离子化效率的显著不同和其他一些歧视固素。例如二两种窄分布的标准品PS10200和和PMMA9200分别溶解在THF中，以几种体积比混合，接着以IAA为基质加甲酸钠或以蒽三酚为基质加三氟乙酸银。在第一套实验方案中，PS和PMMA的体积比从0:1增加到199:1，基质是IAA/Na，也就是对PMMA是最佳条件，试验结果十分令入惊奇，甚至PMMA是以05％的不纯物存在干PS中，质谱图仍然是PMMA的[M＋Na]+峰为主要峰。在第二套实验中，PS和PMMA的体积比从1:0到1:9，基质是蒽三酚/Ag．也就是PS的最优化条件。在所有混合物实验中，PMMA是主要离子，而PS仅以相对干PMMA为10%的峰出现，质谱图上主要是PMMA的峰。当然，这种有利于PMMA的歧视效应也许可以用来检测PS中中痕量的PMMA．但是从这些结果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物还要走很远的一段路。144、嵌段型高分子分析嵌段共聚物之中嵌段和组成分布对于聚合物的最终性能有重要的影响。MALDI-TOF-MS也可以成功地应用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。Wilezek-Vera等MALDI-TOFMS与1HNMR相结合，对苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物进行研究，测定了该共果物的组成分布和嵌段长度，我们研究组研究了荣乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF测得的分子量和以GPC测定的结果参见表。从表中可以青出，对干这类窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得结果与GPC法所得结果比较接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有显著的优越性。MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和MALD/TOFMS法测得的分子量比较15§5.2药物的质谱分析一、生物活性物质分析1、天然产物分析各种提取物的分析，HPLC/MS联用分析RootsLeaves,Bark+Solvent

Filter

ConcentrateLC-MSnWherearetherebiologicallyactivecompounds?16Methanolic

根部提取物024681012141618202224262830Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL进样LC-UV(215nm)17LC-MS,基峰离子流图2468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07Unknow水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL进样18300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5?(M-H)(M-H)负离子ESI全扫描质谱图(FullScanMS)Δ+14uUnknown119120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540RelativeAbundance293.1179.1149.2311.9219.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9293.3307.2193.3325.8219.2179.3294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegativeIonESIDataDependantMS/MSSpectraUnknown1Δ+14um/z17920300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5(M-H)(M-H)ProposedEchinacosideStructureatm/z487增加一个亚甲基21RT:0.11-21.822468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07ProposedEchinacosidesConfirmedEchinacosideOn-The-FlyAnalysis!22大脑促眠素的发现与确证从猫脑袋中取出脑髓液，用液相色谱分离各组分，用电喷雾串联质谱、气质联用、薄层层析、红外及核磁确定各组分的化学结构，目的是找出与睡眠规律有关的物质。在猫睡眠周期的不同时间点采取脑髓液样品，测定各样品的紫外吸收光谱，发现猫在处于即将入睡状态时，脑髓液试样有一个特别显著的紫外吸收峰。电喷雾四极杆串联质谱分析各样品的色谱峰中有显著差异的组分，发现m/z282的离子。并证明是MH+离子，用快原子轰击磁质谱测得其分子式为C18H35NO。CID实验：m/z282的MS2和MS3。在低质量范围，m/z282的子离子谱显示长链烷烃的特征。质量数为17和35的中性丢失是母离子m/z282电离产生子离子m/z265，m/z247时产生的。在以上质谱分析的基础上，综合其它分析手段的表征结果，初步推测出这种催眠素的结构为顺-9,10-十八碳烯酰胺。该化合物的合成和结构表征证实这一结构推测是正确的。23大脑促眠素的MS/MS质谱确定大脑促眠素的化学结构脑髓液中分离出的促眠素化学结构24结构分析：确定代谢途径，微量条件下进行。定量分析：确定生物利用度等，在复杂本底的条件下测定。

OCH3NHClOSNHNHOOOH+OH?parent例：一种非胰岛素依赖型糖尿病药物的代谢分析(Noninsulindependentdiabetesdrug)

代谢物是有效的还是有害的?二、药物代谢分析LC/MS/MS技术2524681012141618202224Time(min)050100RelativeAbundance23.878.7210.6511.8913.0116.79Glyburide代谢物10xOn-lineLC-MSn26100150200250300350400450500550m/z0102030405060708090100RelativeAbundance510512222199279241123391532176399369FullscanMSSpectrumofpeakat8.72minOn-lineData-DependantLC-MSnTriggerMass27150200250300350400450500m/z0102030405060708090100RelativeAbundance369371395352492m/z510>MS2On-lineData-DependantLC-MS228100120140160180200220240260280300320340360m/z0102030405060708090100RelativeAbundance169171304306288m/z510>m/z369>MS3On-lineData-DependantLC-MS329m/z369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z395OCH3NHClOSNHOOO+m/z352OCH3NHClOSOO+m/z304OCH3NHClONH2+m/z288OCH3NHClO+m/z169OOCH3Cl+m/z510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3FragmentationScheme30三、远电荷碎裂反应(Charge-RemoteFragmentation)

远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位置，与质谱解析一章中裂解均与电荷或自由基有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离MS/MS质谱。

高能碰撞：2~10kV，磁质谱仪上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。中能碰撞：100~1000V，扇形电场磁场/TOF联用质谱(特制质谱)。311、远电荷碎裂的主要反应机理长链饱和化合物1,4氢消除反应(1)两步均裂反应(2)产生荷基异位离子末端不饱和离子

长链不饱和化合物(a)近烯丙基键，记作"Ap断裂，Proximalallylbond。远烯丙基-乙烯基键distalallyl–vinylbond,"Avd近烯丙基-乙烯基键，记作Avp断裂，proximalallyl–vinylbond。X=O+

或

OLi2+。3213-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的远电荷碎裂谱图33十八烷酸CID-MIKES谱图，[M-Ht2Li]+

(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z293(B)6,9-二烯十八烷酸m/z293高能碰撞,6kV给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。34长链脂肪酸[M-H]+离子的ES-MS/MS谱图(a)硬脂酸，m/z283;(b)油酸,m/z281;(c)亚油酸,m/z279.谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。中能碰撞，400eV特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。35低能CID谱，[M-Ht2Li]+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸(docosahexaenoicacid,m/z341)。低能碰撞，400eV信息较少，特殊情况使用。36§5.3糖类的质谱分析糖：生命体的能源供给者，传统的认识。糖的生物活性：与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物”(glycoconjugate)，血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和新陈代谢平衡。寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，中药应用，生物多糖，保健药物，保健品。糖结构的复杂性：单糖的组成为CnH2nOn(n=3~9)，其中n=5和6最为常见。每个单糖有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，连接的位置和构型多种多样。37糖类分析的困难性：强极性，分离难，HPLC峰形不好。连接方式复杂，立体化学复杂。同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。电离效率不高、种类有限。16种单糖的常见结构一、单糖及多糖的结构1,核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3,戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖Man6,半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙酰基-(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc389,葡萄糖醛酸GlcA10,鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11,乙酰神经氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脱氧--D-葡萄糖Mur14,鸡纳糖6-脱氧--D-葡萄糖15,泰威糖Tyv16,D-果糖Fru一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征

触角

核心区39二、质谱分析电离方式：FAB：传统的电离方法，主要集中于低聚寡糖的分析。ESI：对于常规的ESI，天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制了ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。MALDI：低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定性，MALDI电离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可以用源后解离(PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。多糖碎片代号表示法非还原端用A,B,C表示。还原端用X,Y,Z表示。左上角标表示，环中两根断裂键所连碳原子的编号(从环上氧原子开始计数，红色数字)，右下角的数字表示残基的序号。40414243HumanGenomeProject§5.4核苷酸(Oligonucleotide)的质谱分析UnderstandingTheGenomeToFightTheDiseaseY2KDrugDesign44500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.6817.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1NegativeIonESIOf18mer(200fg/uL)进样速度：3uL/min

乙腈-甲醇-丙酮(70:20:10,v/v/v,5%TEA)

毛细管温度:100°COLIGO22#209-213RT:1.96-1.99AV:5NL:1.49E5T:-pFullms[450.00-1200.00]45OLIGO22#217-225RT:2.03-2.09AV:8NL:1.63E5T:-pFullms[450.00-1200.00]650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100RelativeAbundance1102.91098.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8NegativeIonChargeStatesof18mer46#1RT:0.00P:-NL:3.85E5T:-pFullms[450.00-1200.00]48005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100RelativeAbundance5520.05498.05541.05565.05745.04788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0GATTCGTAGCTACGAATCReportedAvg.Mol.Wt:5500MonoisotopicMass:5497.7NegativeIonDeconvolutedSpectra47NegativeIonMS2Spectraofthe-5and-7ChargeStatesOLIGO22#435-444RT:4.86-4.98AV:10NL:1.29E5T:-cFullms21098.00@35.00[305.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance926.81071.51134.41068.51236.0817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.71388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22#495-507RT:5.62-5.79AV:13NL:2.65E5T:-cFullms2784.00@35.00[215.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.11485.3306.31782.01880.2GATTCGTAGCTACGAATCGATTCGTAGCTACGAATC48§5.5蛋白质分析一、氨基酸和小肽小肽断裂碎片离子定义49研究小肽的结构：MS/MS分析例：一个五肽的分析具有保护基的五肽的一级结构：

BOC－Gly－Ala－D－Val－Leu－Ile－OBzBOC=t-Butyloxycarbony,Bzl=benzyl.离子类型MH+[MH-56]+[MH-100]+y4"y3"y2"y1"b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158yn"=yn50各离子的生成途径[MH-56]+McLafferty重排[MH-100]+51bn系列离子

yn"系列离子,yn"=yn+252

bn和yn"系列离子生成的另一种机理53氨基酸名称单同位素相对分子量羟胺正离子质量氨基酸名称单同位素相对分子量羟胺正离子质量甘氨酸(glycine,Gly/G)57.0214630天冬氨酸(asparticacid,Asp/D)115.0269487丙氨酸(alanine,Ala/A)71.0371144谷氨酰胺(glutamine,Gln/Q)128.05858101丝氨酸(serine,Ser/S)87.0320360赖氨酸(lysine,Lys/K)128.09496101脯氨酸(proline,Pro/P)97.0527670谷氨酸(glutamicacid,Glu/E)129.04259102缬氨酸(valine,Val/V)99.0684172甲硫氨酸(methionine,Met/M)131.04049104苏氨酸(threonine,Thr/T)101.0476874组氨酸(histidine,His/H)137.05891110半胱氨酸(cysteine,Cys/C)103.0091976苯丙氨酸(phenylalanine,Phe/F)147.06841120异亮氨酸(isoleucine,Ile/I)113.0840686精氨酸(arginine,Arg/R)156.10111129亮氨酸(leucine,Leu/L)113.0840686酪氨酸(tyrosine,Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨(asparagine,Asn/N)114.0429388色氨酸(tryptophan,Trp/W)186.0793115920种氨基酸残基（NH-HCR-C=O）和羟胺正离子的质量54500600700800900100011001200130014001500160017001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷积deconvolution20fmole马心肌红蛋白(HorseHeartMyoglobin)ESI质谱图二、蛋白质分析55原始数据去卷积混合物：主要两种betalactuglobulin56人血红蛋白MALDI-TOF质谱图57鸡蛋溶菌酶ESI质谱图58m/z1=895m/z2=945肌红蛋白ESI质谱图59§5.6蛋白质组学及应用什么是蛋白质组？由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。

蛋白质组的重要性

研究基因组功能的重要途径。

药物目标-在分子水平研究健康和疾病的相关。蛋白质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所有蛋白质。Why蛋白质组学?mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平

蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导

蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态60蛋白质组学面临的挑战•蛋白质没有可进行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。•在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。•物理化学性质的多样性。•动态范围的挑战：相对含量超过106范围(血清中可达1012)质谱测量在蛋白质组学中的作用•质谱是肽(不是蛋白质)的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。•质谱是一种精确的定量工具，尤其是内标法定量(如对同位素比的测量)。•质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。•质谱对已知肽和蛋白质重复定量分析不是很有效。61经典的氨基酸序列分析方法N–端氨基酸单元的分析最常用的有下列两种方法：桑格尔(SangerF)方法：利用肽链N–端游离氨基与2,4–二硝基氟苯(DNP)发生芳香亲核取代反应，而将肽链上的氨基酸逐个分解。埃德曼(Edman)方法：用异硫氰酸苯酯(PITC)和N–端的游离氨基反应，将肽链上的氨基酸逐个分解。

C–端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解经典分析方法的缺点工作量大、测序速度慢、样品用量大。62蛋白质的二维分离63

仪器 鉴定率肽质量指纹谱 MALDI ~50%

(PeptideMassFingerprinter,

PMF)多肽序列标签 LC/MS/MS ~80%

(PeptideSequenceTag,

PST)从新测序

LC/MS/MS >

80%

(DeNovo)蛋白质及混合物的定量分析：同位素编码亲和标记(Isotope-CodedAffinityTags,ICAT)蛋白质序列研究的三个层次64蛋白质组研究技术路线样品(组织、细胞等)凝胶图象分析蛋白质鉴定二维数据库酶解HPLC-MS、MS/MS数据库检索二维凝胶电泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指纹谱肽序列标签从新测序65

一、肽质量指纹谱(PeptideMassFingerprinter,

PMF)PMF测定速度快。PMF灵敏。

PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。66分离的酶解的蛋白质96/384位样品靶数据处理和数据库检索质谱样品的准备MALDI质谱分析蛋白质一级结构结果PMF方法的一般流程67

洗胶/去污

脱水

减少S-S键

洗涤/脱水1、In-gel酶切/消化Multiprobe(4x96WellPlat)

样品体积0.5-100L

板上加热和冷却

消化板加热37oC

肽存储在-4oC冷却板

酶试剂存储在-4oC冷却板

修正-SH基

加入trypsin溶液5-12小时

肽提取2、质谱分析样品的制备

灵敏度：500fmolesBSAin-gel。

移液和消化时间8小时(1x96wellplat)。

最多可进行4x96wellplat的同时消化。基本能力683、质谱测定设这检索的条件，不同软件有不同的参数和用法。MALDI-TOF质谱测定4、数据库检索parmeters参数的选择样品-1样品-2样品-3ProgramusedMS-FitPeptIdentPeptIdentpIrangeNO3~73.7~7.7Proteinmassrange20~50kD15~45kD15~45kDSpeciesearchedMAMMALSMAMMALSMAMMALSDigestusedTrypsinTrypsinTrypsinPeptidemassaccuracy±2Da±0.5Da±0.5DaMethioniceisOxidizedOxidizedOxidizedCysteineisCarbamidomethylation(Cys-CAM)PepptidemassesareAverageMonoisotopicMonoisotopicMumberofpeptides555Numberofmissedcleavages111Numberofpeptideusedinsearch11171569样品1样品2样品3数据库检索结果：带*号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。样品1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶样品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶样品3：丙糖磷酸异构酶70PMF实验，同一点上经常是蛋白质的混合物SomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithlowconfidenceRowdata71AndtherearestillpeptidesunassignedtoaproteinFinalresult72特有的搜索引擎73二、多肽序列标签(PeptideSequenceTag,

PST)和肽阶梯序列(PeptideLadderSequencing)1、肽序列标签蛋白质的常见氨基酸有20种，一般3个氨基酸的肽段碎片将有8000种可能的排列方式4个氨基酸将有160000种排列方式，因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。肽序列标签：一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量。MannM.etal,Anal.Chem.,1994,66,4390forPSTMannM.etal,TrandsinBiochem.Sci.,1996,21,494.74

例：马心肌红蛋白鉴定

马心肌红蛋白胰酶酶切产物的ESI-Q-TOF肽指纹谱75马心肌红蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(双电荷离子)的MS/MS谱图肽序列标签：G—L—S—D—G—E—W—Q—Q—V—L—N—V—W—G—Ky10,1257.8y3,390.3C端N端W—Q—Q—V—L—N—V—WY3,390.3y10,1257.8检索结果：76N端Y—A—M—I—G—D—P—T—G—A—L—RC端y10,1000.5y7,715.4

例：m/z为691.43Da(M2+)，质量数为1380.6Da。

MS/MS图肽序列标签：检索结果：来自乙醇脱氢酶715.4(DGI)1000.5772、肽阶梯序列(PeptideLadderSequencing)梯状测序法(laddersequencing)：用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，相互间差一个氨基酸残基的系列肽，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基，与Edman法相似。AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPITC+5%PICATZ(AA1)+AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnAcid(TFA)

aftermcyclesFurthercycles(withoutseparation)PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA4-AA5--AAn

PC-AAm--AAn一步MALDI-MS阶梯序列数据B.Chaitetal.,Science

262,89,1993.原理：78血纤维蛋白肽:ProteinladderSequencing[Glu1]fibrinopeptideB79传统的低能量CADMS/MS质谱图80MALDIPSD与高能CID的比较81可选择性的碎裂方式：光诱导解离(UV-193nm)

相当于高能CID。多光子电离(IR-10.6μm)

相当于低能CAD。表面解离(SID)相当于低能CAD。电子捕获解离(ECD)c和z类型碎片增强。注：这些方法在自动化大批量实验中并不是常规的方法。

数据库搜索为什么会失败蛋白质不在数据库里或者不正确的搜索参数(酶特征，分类法等等)。在数据库里蛋白质表达不正确(DNA核苷酸序列，基因内区序列等等预测失败)。蛋白质变性.-变性的氨基酸残基-N端和C端的变化：蛋氨酸的形成，序列信号变化，C链缩短-可变的序列(同族以及选择性结合的变体)-后修饰变化(糖基化，磷酸化等)-不希望的化学诱导修饰(在尿素中氨甲酰化)搜索引擎不够完善成熟。82三、重新测序(Denovosequence)数据库中没有的蛋白质分析样品来源于非序列化基因组蛋白质经多重高度修饰在实际生物体中，非同寻常的酶活性处理古生物样本，样品处理时肽被修饰(污染)合成肽重新测序的原因

谱图的预处理多电荷峰转化成单电荷峰多同位素峰转化成担同位素峰简化谱图提高信噪比83谱图处理谱图分析84

16O/18OC端标记为了提高对串联质谱数据的解读能力，尤其是对y和b型离子系列的辨别能力，用化学修饰方法使辨别更容易。

16O/18OC端标记：在蛋白质酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羟基氧18O/16O的(M+2/M)同位素丰度比高于正常的峰强度，据此可以分辨出y系列离子。给出C-端离子的唯一特征碎片离子85denovo序列解释马尔可夫链蒙特卡洛(MarkovchainMonteCarlo)denovo

序列产生算法贝叶斯规则(Bayesian)断裂方式和谱图匹配算法Beta牛乳糖m/z841.5的MS/MS