第九章吸光光度法

第九章吸光光度法Spectrophotometry9-1吸光光度法基本原理9-2光度计及其基本部件9-3显色反应及显色条件的选择9-4吸光度测量条件的选择9-5吸光光度法的应用9-6紫外吸收光普法简介*概述吸光光度法

是基于被测物质的分子

对光

具有选择吸收的特性而建立的分析方法。比色法可见分光光度法紫外分光光度法*目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高*分光光度法（紫外-可见分光光度法）UV-VIS0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品未考虑吸收池和溶剂对光子的作用注意比较*吸光光度法特点：1）检出限低10-5-10-6mol/L2）灵敏度高，适于测定微量组分3）误差2-5%4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广泛*9-1吸光光度法基本原理射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光一、物质对光的选择性吸收*单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿*完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光*光吸收原理物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子跃迁引起的，故又称电子光谱.纯电子能态间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3Ah分子内电子跃迁带状光谱A锐线光谱S2S1S0*吸收光谱（吸收曲线）测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同波长光的吸收能力。*吸收曲线的讨论：①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。*讨论：④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。*定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大*二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律透光率（透射比）Transmittance透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%*吸光度与透光率AbsorbanceandtransmittanceT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%*吸光系数Absorptivityb吸光液层的厚度，光程，cmc吸光物质的浓度：

g/L,mol/LK

比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c：mol/LK

（或k）摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-1c：g/LK

a吸光系数，L·g–1·cm-1c：g/100mLK

比吸光系数相互关系100mL·g–1·cm-1*吸光的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即对吸收定律偏离AC主要原因非单色光吸光质点的相互作用*非单色光引起的对吸光定律的偏离设入射光由1

和2

两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律121+2或或*非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，b和c固定，反映了随波长变化的情况，单一波长，

固定；不同波长，

不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。A或12在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。1对应的1较小2对应的2较大选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。*吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离质点间的静电作用质点间的缔合作用质点间的化学反应*0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品未考虑吸收池和溶剂对光子的作用注意比较9-2光度计及其基本部件*单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示*比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器单波长双光束分光光度计*双波长

将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。ΔA=Aλ2-Aλ1=(ελ2-ελ1)bc=Kc*一、基本组成

generalprocess光源单色器样品室检测器显示1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。*

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；使不同波长的辐射以不同的角度进行传播；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。*棱镜—根据光的折射现象进行分光棱镜对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光，折射率小；波长短的光，折射率大。平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；

棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；*光栅

通过在平板玻璃或金属板上刻划出一道道等宽、等间距的刻痕制成。常用的光栅刻痕密度每毫米为1200条、1800条或2400条；根据工作方式不同分为：透射光栅，反射光栅；光栅光谱的产生是多狭缝干涉与单狭缝衍射共同作用的结果，前者决定光谱出现的位置，后者决定谱线强度分布；*光栅的色散原理*狭缝

单色器的进口狭缝起着单色器光学系统虚光源的作用。复合光经色散元件分开后，在出口曲面上形成相当于每条光谱线的像，即光谱。转动色散元件可使不同波长的光谱线依次通过。

*3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理*紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯，氘灯，180~375nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光栅，反射光栅玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示基本组成总结*9-3显色反应及显色条件的选择显色反应显色反应：将待测组分转变成有颜色化合物的反应

在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、氧化还原反应等。用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求：

⑴选择性好，干扰少；

⑵灵敏度高；εmax=104-105→灵敏度高εmax<103→灵敏度低⑶有色化合物的组成恒定；

⑷有色化合物的性质稳定

⑸色差大Δλ〉60nm

*显色条件的选择

吸光光度法是测定显色反应达到平衡后溶液的吸光度，为了得到准确的结果，必须从研究平衡着手了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使反应完全和稳定。*显色反应的主要条件显色的主要条件有以下几点：

（1）显色剂用量显色反应一般可以用下式表示：M+R＝MR

为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要的，但过量太多，有时会有副反应产生，反而不利。*吸光度与显色剂用量关系图是吸光度与显色剂用量关系的几种情况。图2－11吸光度与显色剂用量的关系

从三个图中可以得到：

可以选用的用量较宽

可以选用的用量较窄

表明随着显色剂用量的增加，吸光度也不断增大。

*（2）溶液的酸度

溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的

:

例如由于显色剂大多是有机弱酸，酸度影响显色剂的离解，因而影响显色剂反应的完全程度。又如许多显色剂本身就是酸碱指示剂，配位反应后的颜色必须与显色剂本身的颜色有显著的不同。二甲酚橙pH>6.3呈红紫色，pH<6.3呈黄色，与金属配合物则呈红色，故只适合于pH<6.3的条件。*（2）溶液的酸度酸度还影响配合物的组成，Fe3+与磺基水杨酸(Sal2-)的反应就是一个典型的例子。pH=1.8～2.5Fe3＋＋Sal2－＝Fe（Sal）＋紫红色pH=4～8Fe3＋＋2Sal2－＝Fe（Sal）2－紫褐色pH=8～11.5Fe3＋＋3Sal2－＝Fe（Sal）33＋黄色pH>12配合物被破坏，生成Fe（OH）3

沉淀*（3）显色时间的影响由于反应速率不同，完成反应所需的时间常有很大差别同时，有色化合物在放置过程中也会发生变化。有的迅速反应且能稳定较长时间（如Fe3+与磺基水杨酸反应）。有的放置一段时间反应才达平衡，溶液颜色才达稳定程度（如硅钼蓝的生成）。有的放置一段时间后由于各种原因，如空气氧化、试剂分解或挥发、光照射等而褪色（如硅钼蓝只稳定0.5～1h）。

*（4）温度对显色反应也有影响如Fe3＋与磺基水杨酸反应室温就能进行，硅钼蓝的生成如果在沸水中则只需30s。

*（5）干扰离子的影响及其消除有的干扰离子本身有颜色，如Cu2＋（蓝）、Co2＋（红）、Cr3（绿）、Fe3＋（黄）；有的与试剂生成有色配合物，如硅钼蓝法测Si时，P、As也与钼酸铵生成杂多酸且同时被还原成钼蓝干扰测定；有的与试剂或被测离子生成更稳定化合物，使被测离子配位不完全等。因此，对与一个新的比色方法的提出，往往必须做干扰离子试验。*干扰离子的消除对于干扰离子的消除通常采用下述方法。（1）加入配位剂掩蔽干扰离子如测Ti4＋时，Fe3＋黄色干扰，可加H3PO4使其成为Fe（PO4）3－（无色）。（2）调节溶液酸度如硅钼蓝在酸度4～6mol/L仍然稳定，但磷砷钼蓝在1.6mol/L以上时则被破坏。*显色剂无机显色剂:有机显色剂:生色团从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团（发色团）。具有不饱和键π电子的基团，产生π→π*跃迁，跃迁ΔE较低,往往是生色团注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强助色团：有一些含有n电子的基团，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生p—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。

*红移与蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。增色效应和减色效应——波长不变

增色效应：吸收强度增强的效应

减色效应：吸收强度减小的效应有机显色剂种类(1)偶氮类显色分子中含有偶氮基(2)三苯甲烷类*三元配合物的分析特性如果显色反应加两种显色剂可以形成三个组分的混合配合物。这种方法大大的提高了显色剂的稳定性、灵敏性、选择性。

三元配合物比较稳定,可提高分析测定的准确度和重现性。例如Ti-EDTA-H2O2三元络和物的稳定性比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元络和物的稳定性分别增加强约1000倍和100倍。*三元配合物的分析特性三元络合物对光有较大的吸收容量,所以进行光度测定时它比二元络合物具有更高的灵敏度。如用H2O2测定钒，灵敏度太低(=2.7×102)。而用PAR显色灵敏度虽有提高，但选择性差。如果将V5+、H2O2、PAR三者混合,一定条件下则形成紫红色的三元络合物，灵敏度可大大提高(=1.4×104)，最大吸收波长也移至540nm（原最大吸收波长为450nm），出现较大红移。

*三元配合物的分析特性形成三元络合物的显色反应比二元体系具有更高的选择性。这是因为在二元络合物中，一种配位体常与多种金属离子产生类似络合反应，而当体系中两种配位体形成三元络合物时，就减少了金属离子形成类似络合物的可能性。例如：铌和钽都可与邻苯三酚生成二元络合物，但是在草酸介质中，只有钽能与邻苯三酚形成黄色的钽-邻苯三酚-草酸三元络合物，铌则不能形成类似的三元络合物，因而提高了反应的选择性。*三元络合物在光度分析中的应用特点三元络合物在光度分析中的应用特点还有很多：

可以改善显色条件,例如有CTMAC（氯化十六烷基三甲基胺）存在时,Al3+与络天青S形成三元络合物比没有CTMAC时形成二元络合物的pH范围宽;

具有较好的萃取性能,例如Mn2+在pH>11时能与双硫腙形成有色络合物,加入吡啶萃取时,稳定的三元配合物大大提高了萃取率。*9-4:光度测量误差和测量条件的选择cb

测量灵敏度=——·M·106

1000

0.001MS=——

·M·103=——(μg/cm2)εεA

显色反应灵敏度：ε=——(L·mol-1·cm-1)bc*检测计标尺上A与T的关系若测A时产生微小的绝对差dA，则相对误差Er为：Er=dA/A；A=εbc当b一定时，两边积分得：dA=εbdcdc为测量浓度时的绝对误差，二式相除：dA/A=dc/c=Er因c∞A，故dc亦正比dA而测量时Er相等，上式成立。一.仪器测量误差

*ΔT-仪器刻度读数不可靠所引起的误差（±0.2%～±2%）*[例如]某光度计的透光率刻度读数误差为△T=±1%，计算下列各百分透过率时浓度的相对误差△c/c，指出△c/c<4%时，百分透光率读数范围T%=1，10，20，30，50，70，80，90T=0.01，0.02，0.03，0.50，0.70，0.80，0.90△c/c（%）=21.7，4.34，3.10，2.77，2.88，4.00，5.60，10.54[解]为使结果为正，△T取负值

*用误差公式：△c0.434△T0.434(-1%)

——=————=—————=21.7%

cT·lgT0.01·lg0.01由计算可知：此时吸光度在0.20-0.80之间A=-lgT=-lg0.368=0.434

此时相对误差最小。△c当——(%)<4%时；T为15–65%

c*影响测定结果的相对误差两个因素：

T和ΔTΔT-仪器刻度读数不可靠所引起的误差（±0.2%～±2%）当T=0.368（A=0.434）时，浓度相对误差最小当吸光度在0.15~1.0范围内浓度的测量误差约为1.4%-2.2%*二.测量条件的选择1.入射光波长的选择：最大吸收的原则λmax2.控制吸光度读数范围：调c或b，使A介于0.2--0.8

3.参比溶液的选择：选合适的参比溶液，调仪器A=0，T=100%

*参比溶液的选择⑴如果样品溶液、试剂、显色剂均无色时，选溶剂作参比，称为“溶剂空白”；⑵如果样品溶液有色，而试剂、显色剂无色时，选不加显色剂的样品溶液作参比，称为“样品空白”；⑶如果试剂、显色剂有色，而样品溶液无色时，选不加样品的试剂、显色剂溶液作参比，称为“试剂空白”。(4)显色剂与试液均有颜色,可将一份试液加入适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与显色剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比溶液,可以消除显色剂和一些共存组分的干扰.(5)改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,以此溶液作为参比溶液消除干扰.*9.5吸光光度法的应用

一.标准曲线法测单一组分1.选择合适的显色反应和显色条件2.绘出被测组分的吸A收光谱曲线(用标液)λ3.在λmax下测一系列标准溶液A的A值，绘制工作曲线A---c4.与工作曲线相同的方法，测未知物AX，从工作曲线上查cX

AxλCx*

[例1]用phen测微量Fe2+：

(1)cFe(标)=100μg/mL100×10-6=————=1.79×10-3mol/LM——1000

b=1cm：VFe(标)(mL)：0.20，0.40，0.60，0.80，1.0/50mL容量瓶A508：0.080，0.150，0.225，0.300，0.375*(2)试样水泥→50ml显色与标准曲线方法相同，测A=0.770

MFe

——1000(3)计算Fe%=cXV50——×100mS

*

[例2]称钢样0.500g，酸溶解，将锰全部氧化为MnO4-，转移到50mL容量瓶中，摇匀，从中取5.00mL→50mL容量瓶定溶，用2cm比色皿在λ525nm，ε=2235，测A=0.124，计算Mn%=？(Mn=54.94)

[解]A0.124c2=——=————=2.77×10-5mol/L

εb2235×2MMn

c2

·50·——1000

Mn%=——————×100=0.1525.000.500·——50*

[例3]Phen测Fe，欲配Fe2+标液1L，使其稀释100倍时，放在1.0cm的比色皿中，测得A=0.50，问称取(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O(Mr=392.13)多少克？(ε=1.1×104)

[解]设稀释后A0.50cFe2+=——=—————=4.5×10-5mol/L

εb1.1×104×1.0所以：

mS=c·V·M=4.5×10-5×100×392.13=1.8g*

[例4]某试液用2.0cm比色皿测T=60%，若改用3.0cm，求T%和A

[解](1)A=-lgT=-lg0.60=0.222=εbcA1b1b2(2)——=——A2=——A1=0.333A2b2b11100(3)A=2-lgT%=lg(——)=lg(——)TT%lgT=2-A=2-0.333=1.667T%=46.45*

[例5]称纯Fe0.5000g溶解定容1000mL作标准Fe，取10.0mL稀释→100mL，取5.0mL显色定溶50mL，测As=0.230；称试样1.500g溶解定容250.0ml，从中取5.00ml与标准曲线相同方法测Ax=0.200，求试样Fe%=？

[解]0.500g

———·10.010005.0c标=——————

×

——=5.0×10-6g/mL100mL50A标

AS0.230c标5.0×10-6

——=——=———；——=————

A样

AX0.200c样

c样

*因为BeerLaw：

ASAX

——=——

cScXAX

所以cX=——

×cS=4.35×10-6g/mLAS

4.35×10-6g/mL×50mL

所以Fe%=———————————

×1005.01.50g——

250=0.725*一.多组分的定量方法三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量9-6吸光度法的其他应用*2．两组分吸收光谱部分重叠λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca

*解线性方程组法3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定*