动物重要病原菌功能基因组与分子致病机理研究

项目名称：动物重要病原菌功能基因组与分子致病机理研究

周锐华中农业大学2012.1-2016.8教育部湖北省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题病原菌在动物和人中的流行与传播机制结核病是全球死亡人数最高的人类传染病，主要由结核分枝杆菌引起，但10％973为人结核分枝332414162病原菌的蛋白质互作与基因调控网络在后基因组时代，生命科学领域的研究人员面临的问题不再仅仅是某个基提供新的药物靶标和策略。病原菌的致病与免疫逃避的机制传染病的发生、发展与转归是病原微生物与宿主相互作用的结果，不同病深入研究的重要基础科学问题。（二）主要研究内容以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌等重要动物病原菌为研究对象，综合运用分子流行病学、现代细菌学、分子免疫学、功能基因组学、蛋白质组学、糖组学等研究手段，开展如下研究：进一步开展牛结核、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的病原学与流行病学研多样性和抗原多样性的遗传基础。菌的全菌蛋白质-蛋白质相互作用网络，发掘与细菌生长、代谢、毒力调控和耐药相关的新关键因子和药物靶标。以结核分枝杆菌、猪链球菌等病原菌为研究对象，进行细菌糖组学研究，面多糖的合成途径和生物学作用，深化对这两种病原菌的生长及感染机制的认识，为抗菌药物开发新策略提供理论基础。研究人结核分枝杆菌对牛的致病性，鉴定牛分枝杆菌、猪链球菌和副猪嗜号传导途径，研究猪链球菌与副猪嗜血杆菌的协同致病作用及其机制。研究结核病发生、发展和转归过程中炎性因子的变化及其调控机制，牛分乱的机制。二、预期目标（一）总体目标以结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌为研究对象，初步阐明DNA（二）五年预期目标500200（及牛型2000完善和构建结核分枝杆菌和猪链球菌的蛋白质相互作用网络和转录调损伤修复与耐药之间的关系。Sir2Sir2蛋白与牛分枝杆菌致病性及药物作用机理之间的关联性。鉴定结核分枝杆菌和猪链球菌表面多糖及结核分枝杆菌细胞壁多糖的105种重要表面多糖的组分和结构，明确其在细菌生长及致病中的关键作用。初步阐明人结核分枝杆菌对牛的致病特征；鉴定猪链球菌、副猪嗜血杆208－10协同致病作用和机制。发表SCI50－60/15－205－6100－150三、研究方案（一）总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性分析总体研究思路结核分枝杆菌复合群、猪链球菌和副猪嗜血杆菌是严重危害畜牧业健康发技术路线ORF组的克隆及蛋白质互作与基因调控ORF组的克隆及蛋白质互作与基因调控菌株分离鉴定糖基供体合成酶和糖基转移酶基( 因的克隆与功能网络构建一)病原菌在动物和人中的流行和传播机制DNA代谢相关蛋白相互作用亚网络解析研究研究血清型/基因型（二）蛋白质互作与基因调控网络（三）胞外多糖的结构与功能耐药性代表菌株复制与损伤修复及耐药机制功能基因和蛋白质新药靶标胞外多糖流行环节与溯源析致病性猪链球菌与副猪嗜血杆菌协同致病机制与宿主相互作用及信号传导通路结核病发生发展和转归中炎性因子变化及调控牛分枝杆菌的免疫逃避机制猪链球菌诱导炎症紊乱机制（四）感染与分子致病机制 （五）免疫应答与免疫逃避机制可行性分析工作基础：本项目是在2010年结题验收的973计划重大传染病基础研究专（2006-2010的基础上滚动申报的。已结题的973973人才队伍：本项目的研究队伍来自教育部属大学、中科院和中国农科院等优势单位，结构合理，年富力强，专业特长突出，学科交叉。项目组绝大多数人973本项目有优秀的人才队伍保障。技术平台：本项目涉及的关键研究技术平台，包括分子流行病学、基因组支撑条件：本项目涉及的七个单位拥有与该申请项目研究领域相关的4个31III（二）项目的创新点与特色在我国，结核病在动物（特别是牛）样性与抗原多样性的遗传基础，为三种传染病的防控提供科学决策依据。从结核分枝杆菌和猪链球菌的全局性蛋白质相互作用网络和基因调控网从克隆鉴定参与结核分枝杆菌和猪链球菌的表面多糖合成途径的重要糖从病原菌及其重要组分（蛋白质、表面多糖）与宿主相互作用及其信号为揭示三种细菌性传染病的发生、发展与转归机制提供科学数据。（三）课题设置课题1、病原菌在动物和人中的流行与传播机制1．主要研究目标揭示结核分枝杆菌复合群在牛和人中的流行规律与传播机制、猪链球菌和的遗传基础，为这三种传染病的防治提供理论依据。主要研究内容究人结核分枝杆菌在牛等动物中的流行情况与致病性及牛分枝杆菌在人间的流行情况；通过流行环节和溯源研究，揭示结核在牛－人间的传播规律与机制。细菌分离鉴定和保藏：从动物和/或人中分离鉴定一批结核分枝杆菌定，为基因变异和分子流行病学研究积累材料与资料。病原菌基因变异研究：通过全基因组重测序和/或全基因组扫描分析三种病原菌的基因组序列的变异（SNPs、基因缺失和基因重排等，确定变异的基础。承担单位、课题负责人和主要学术骨干承担单位：华中农业大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、宁夏大学课题负责人：郭爱珍主要学术骨干：刘思国、王玉炯、蔡旭旺经费比例：22％课题2、病原菌的蛋白质互作与基因调控网络1．主要研究目标构建或完善结核分枝杆菌和猪链球菌的蛋白质相互作用与基因调控网络，Sir2Sir2关系。主要研究内容DNADNA2牛分枝杆菌蛋白质乙酰化及其与致病性和耐药性的关系研究：鉴定牛Sir2Sir2病性及药物作用机理之间的关联性。承担单位、课题负责人和主要学术骨干承担单位：华中农业大学、中国科学院武汉病毒研究所课题负责人：周锐主要学术骨干：张华、谷晶、徐卓菲、金卉经费比例：26％课题3、病原菌表面多糖的结构与功能1．主要研究目标以结核分枝杆菌、猪链球菌等病原菌的表面多糖为对象，通过对参与其生疫苗及药物开发奠定基础。主要研究内容的基因；合成途径；菌细胞表面多糖的生物学与免疫学功能；合成病原菌多糖或类似物，分析验证多糖的生物学作用，进行病原菌承担单位、课题负责人和主要学术骨干承担单位：中国科学院微生物研究所、华中农业大学、大连医科大学课题负责人：李学兵主要学术骨干：马郁芳、谭臣经费比例：16％课题4、病原菌感染与分子致病机制主要研究目标初步阐明人结核分枝杆菌在牛群中的感染与致病特征；阐明猪链球菌和副理损伤及其机制。主要研究内容毒力因子。染后对宿主免疫系统的影响及致病力的变化，研究病原间协同致病机制。承担单位、课题负责人和主要学术骨干行病研究所课题负责人：陆承平主要学术骨干：范红结、姜永强经费比例：16％课题5、病原菌的免疫应答与免疫逃避机制1．主要研究目标鉴定结核病发生、发展与转归过程的分子标识；初步阐明自噬在牛分枝杆菌感染的先天性免疫和获得性免疫中的作用及其机制，揭示牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制；阐明猪链球菌引起急性炎症和导致炎症紊乱的机制。主要研究内容结核病发生、发展和转归的研究：研究结核病发生、发展和转归过程牛分枝杆菌免疫逃避以及引起慢性炎症的机制研究：比较研究牛分枝（ROS/siRNA承担单位、课题负责人和主要学术骨干承担单位：扬州大学、华中农业大学课题负责人：焦新安主要学术骨干：金梅林、张安定、贝为成经费比例：20%（四）各课题间的相互关系本项目的总体目标是：进一步阐明动物结核杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的流行特征与传播机制，解析三种病原菌的重要基因、蛋白质和多糖的结构、功能及其相互作用与调控网路，深入揭示病原菌的致病机理和免疫机理，为这三种传染病的防控提供必要的科学理论依据。51）病原菌在动物和人中的流行与传播机制（2）（3）病原菌表面多糖的结构与功能（4）（5）病原菌的免疫应答与免疫逃避机制。课题设置的思路：紧密围绕细菌性传染病的三要素病原菌、宿主和环境及123454523务于项目总体目标的实现。病原菌环境病原菌环境课题一、病原菌在动物和人中的流行与传播机制课题二、蛋白质互 课题三、胞外多作与基因调控网络 的结构与功能基因、蛋白质 表面多糖课题四、感染与分子致病机制课题五、免疫应答与免疫逃避机制宿主图1.课题设置思路示意图四、年度计划年度

研究内容 预期目标确定病原菌流行病学样品的采对方案和规范进行示范和调研；病原菌新毒力相关基因的发掘糖链合成相关基因簇,克隆、表达部分关键基因。结核分枝杆菌：研究人结核分第DNAmbSir2；一猪链球菌：细菌双杂交载体和表达载体改造及猪链球菌ORF年（中筛选可诱导技术鉴定出病原菌感染过程差异。

31305050鉴定三种细菌新毒力相关基因1058-10关蛋白；初步完成结核分枝杆菌代谢蛋白质亚网络的构建；完成mbSir2完成载体改造，猪链球菌ORFPCR完成精细文库构建；重组表达个猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白；确定猪链球菌可以诱导宿主细胞炎性因子释放的组份；鉴定在病原菌感染过程中宿主细胞内磷酸化水平改变蛋白；鉴定一批副猪嗜血杆菌强弱毒发表SCI6-9项。年 研究内容 预期目度获得三种细菌流行病学样本，序列变异的分析；构建筛选用细菌双杂交重组质完善结核分枝杆菌DNA代谢蛋白质mbSir2化蛋白及其乙酰化位点的确认。第对结核分枝杆菌和猪链球菌的关键基因进行生物化学分析并测定3D二基转移酶缺陷株。建立猪链球菌、副猪嗜血杆菌年研究结核病发生、发展和转归鉴定牛分枝杆菌的免疫应答与免疫部分细菌蛋白为诱饵筛选宿主的相定与猪链球菌感染相关的宿主免疫素分子。

获得160成分型鉴定；对所收集菌株进行全基>503302000ORF20-30个表达纯化的猪链球菌蛋白质；完成DNA2-3DNA基因的酶特性分析；得到关键基因的3D5破血脑屏障的细胞模型；程中炎性因子的变化规律；筛选3-5种牛分枝杆菌免疫应答或逃逸新蛋50-60SILAC5个副猪嗜血杆菌毒素分子，表达纯化毒素蛋白；发表SCI12-152-3年 研究内容 预期目度继续获得三种细菌流行病学样因组序列变异的分析；猪链球菌文库的双杂交筛选；表达及纯化结核分枝杆菌重要（去乙酰化酰化对相关蛋白质功能的影响；第构建分枝杆菌和猪链球菌关键三杆菌胞壁多糖的结构和猪链球菌荚化学与酶法结合的合成研究；年（4）毒力因子与宿主细胞互作及互作的信号传导途径研究；（5）筛选结核病发生、发展与转归ThCTL

获得160成分型鉴定；对所收集菌株进行全基>50320基本完成猪链球菌文库的双杂DNA61-2菌突破血脑屏障的机制；争取获得结核病的分子标识，阐1-2表达纯化全部猪链球菌表面蛋白和分51-2发表SCI12-154-5年 研究内容 预期目度继续获得三种细菌流行病学样因组序列变异的分析；对鉴定的猪链球菌相互作用共现的部分重要互作蛋白进行共沉淀系统；完成结核分枝杆菌重要复制修复基因敲除菌株及超量表达机理和对牛分枝杆菌毒力的影响;第分析结核分枝杆菌和猪链球菌糖基转移酶及多糖链对感染过程的四活性;比较猪链球菌、副猪嗜血杆菌年系统的影响及致病力的变化;比较研究牛分枝杆菌强弱菌株探索自噬在天然免疫和获得性免疫中与细菌的相互作用以及这些过程

获得150成分型鉴定，同时获得基因组的完成300完成猪链球菌互作蛋白的基因500系，完成10-15个互作蛋白的共沉淀和功能分析；得到结核分枝杆菌DNA复制修复基因敲除菌株及超量表达菌株；建立牛分枝杆菌蛋白质乙酰化对细菌耐药性的关联性及立蛋白质乙酰化与细菌毒力的关联性；获得关键基因及多糖链的免疫5-82揭示病原菌在树突状细胞内存8-10SCI15-204-5年 研究内容 预期目度建立流行菌株菌种库；分析基因组序列的变异与致病性及发病特DNA复基因突变菌株在不同生长条件下的差异表达分析；绘制猪链球菌全局性蛋白质相第毒力相关的新功能基因及蛋白质；菌毒力和药物作用机理的影响;五研究酶底物类似物（抑制剂）糖链或糖链类似物的免疫原性;年以实验动物为模型研究结核分的机制。研究分枝杆菌等相关分子在逃项目总结。

菌株菌种库，总结结核分枝杆菌、副猪嗜血杆菌和猪链球菌在我国流行的基因型与血清型的动态变化规律，及结核菌在人和牛之间的传播规律与机制；DNA复制修复基因的功能