交大分子生物学课件乔,老师-第2章复制

Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 TherevisedcentralSagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 第一节半保 Sagiv精英名校考 (semiconservative 模型(conservative(DispersiveSagiv

ReplicationSagiv精英名校考 半保 的验证实chromatiddifferentialstaining）5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，简称BUdR） （Harlequinchromosome）四、 模型—θSagiv精英名校考 In1958,M.Meselson&F.W.Stahlsetoutdistinguishreplication用agiv英名 培养15N标记的大生生物学最美丽的实Sagiv精英名校考

14N15N 15N15N 14N14N15N 15N Sagiv精英名校考 Taylor H按半保 预期DNA 过程中标记情况实验结 放射自显影的图示Sagiv精英名校考 姊妹染色单体差别染T/M

MMMSagiv精英名校 ttp://s 2 于三致物质的检2姐妹染色单体互换Sagiv

模+CE1.5B放射自显影11-7Cairns实验原理及过程InonE.coliwith3H-T.θSagiv精英名校考 第二 的起点、方向和终用同位素标记电镜观察及变性不同步培 双向电泳Sagiv精英名校考 t 定起始点,单向

状上有两记位点：起12341231234123121图11-11不同步培养时各标记的拷起点标记的拷贝数应Sagiv

双向电泳定 + +

第一组中性琼脂糖电 第二组第一组中性琼脂糖电

2杂

12-13双向电泳定位Sagiv原核

起点和E.coli定点、双向对 T7在近一端的17％处开始，向两端延伸枯草杆菌有固定的起始点，双向不对 质粒R6K早期为单向

了约质粒ColE1有固定起始点，但却为单 Sagiv精英名校考 原核生物中特殊 类 11-14 Sagiv 真核有固定的多 起点，双向等 为Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Replicationeyesreplication复 Rollingcirclereplication滚环复D-loopreplicationDSagiv精英名校考 /larReplicationforkisthepointatwhichstrandsofparentalduplexDNAareseparatedsothatreplicationcanproceed原核生物的和质Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Rollingcircle1968年Gilbert提出滚 模型共价延伸模板链和新合成的链分开不需RNA引物，在正链3‘－OH上延只有一 形成多联体（concatemerSagiv精英名lli3 位点特异性起始蛋白-A蛋Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 滚 的电Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.Sagiv精英名校考 哪些DNA进行滚 噬菌体ΦX174噬菌体 后 F因子DNA的转Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 QQ:3' TraY/I多体在环上移动，DNA

DNA图 F因子DNA的转移(仿B.Lewin:《GENES》Sagiv精英名校考 D-loopDloopsmaintainmitochondrialDNA两条链 起点不在同一位 Sagiv精英名校考 TheDloopmaintainsanopeninginmammalianmitochondrialDNA,whichhasseparateoriginsforthereplicationofeachstrand.Sagiv精英名校考 哪些DNA进行D- 线粒体叶绿体少 （如 Sagiv精英名校考 第三节 的基本特Sagiv精英名校考 的特+反应需接受模板的指导（base-的方式是半保链延伸需要有引物3’链延伸方向为5’-产物DNA的极性与模板相起始于特定的区Hydrolysisofpyrophosphate(PPi)isthedrivingforceforDNAsynthesisQ3 triphosphatesSubstrateSubstraterequiredforDNASagiv

Primer（引物SubstrateSubstraterequiredforDNASagiv精英名校考 PrimingisrequiredtostartDNA’Sagiv精英名校考 NA－羟，Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 第四节 Sagiv精英名校考研 htt 用Q:4561 DNApolymeraseisabletosynthesizeDNAfromfourdeoxynucleoside5’-triphosphates(dNTP)aslongasaDNAmoleculartobecopiedisprovided.Catalyzedchemicalreaction:Poly(nucleotide)n-3’-OH+dNTP→Poly(nucleotide)n＋1-3’-OH+PPiSagiv精英名校考 DNA需要提供合成模板不能起始新的链，必须要有引物提供合成的方向都是Sagiv精英名校考 DNApolymerasesSagiv精英名校考 DNApolymerasesareenzymesthatsynthesizeadaughterstrand(s)ofDNA(underdirectionfromaDNAtemplate).MaybeinvolvedinrepairorDNAreplicaseisaDNA-synthesizingenzymerequiredspecificallyforreplication.Sagiv精英名校考 Semiconservativereplicationsynthesizestwonewstrandsof

RepairsynthesisreplacesadamagedstrandofDNASagiv精英名校考 DiscoveryofDNAPolymeraseⅠinIn1957,A.Kornberg(1918-)1stisolatedtheenzymein plishedtheinvitrosynthesis Sagiv精英名校考 E.colihasfiveDNAOnlyoneDNApolymeraseisthereplicase.TheothersparticipateinrepairofdamagedDNA.Sagiv精英名校考 E.coli中的三种DNA多聚DNApolDNApol分子10990900构单单异多聚分子数/？10-+++3`→5`外切+++5`→3`外切+-突变位polpol dnaZX,dnaQ,dnaT突变表修复有缺能修Sagiv精英名校考 DNA109kD，二级结构以α-螺旋为主活性5`→3`聚合酶活性: 中起辅助作3`→5`外切酶活性5`→3`外切酶活性：引物切除、损伤内切酶活 Sagiv精英名校考 I有6个结合位点(1)(2)(3)(4)(5)(6)

模板结合位点引物结合位点3'→5'校正位点。Sagiv精英名校考研

···· 3'－5

··· 11-20DNA3'－5'D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》

D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》Sagiv精英名校考 小片段：323个氨基酸残基，5`→3`外切酶活3`→DNApol肽链上具有三种酶Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 NickSagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 SomeDNApolymeraseshaveacommonstructureSagiv精英名校考 DNA聚合酶具有共同的体，提供催化活性Sagiv精英名校考 DNApol(DNA聚合DNApolconsistsofmultiplesubunitsα、ε、Holoenzyme（全酶）referstoanenzymethatcontainsseveraldifferentsubunitsandretainssomeactivityevenwhenoneormoresubunitsisCore 酶α亚基5`3`聚合酶活ε亚基：3`→5`外切酶θ亚基：组 酶复合是原核生物体内真正 作用的Sagiv精英名校考 滑动钳装配滑动E.ColiDNApolSagiv精英名校考 全酶在DNA上的装配分为三个一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物DNA在与β,γ复合体结合的位点构象发生改变， 而对 酶产生了高亲和。使酶能与DNA结合τ二聚体结 聚合酶，使其二聚化Sagiv

α130

ε25θ10

装到DNA上 装配器水解 / δ'ψχ PolⅢ*(470KD)增加进行性

PolⅢ'(750K)使γδ复合体结合模 32KD

ψχ52

β

ψχ

前导链的合 后滞链的合 βδ

δ'ψ τ Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考

τ：71K(dnaZX)— δ：32KEFⅢ,催化β亚基转移到模板链上。 γδ复合

Sagiv精英名校考 复合体Sagiv精名 in/ 复合体Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 二DNAligase（DNA连接酶LigationofOkazakifragmentsarelinkedbyDNAligaseSagiv精英名校考 DNA连接酶的作用机制分三步进1、2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 又称双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizing在E.coli分子量为Sagiv精英名校考 四解链酶是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能

结

330K

结合与OriC,Oriλ参与 ATP 66K 82K

体

F 4

58

T7 Sagiv精英名校考 Sagiv精英名校考 五 Sagiv精英名校考 促旋酶释放解螺旋时产生的Sagiv精英名校考 六 是一种依赖DNA的RNA E. 聚合酶活性中N

CDNA结合结构 与DnaB相互作Sagiv精英名校考 参与Sagiv精英名校考 第五Sagiv精英名校考 子RepliconisaunitofthegenomeinwhichDNAisreplicated.EachrepliconcontainsanoriginforinitiationofreplicationTheoriginisasequenceofDNAatwhichreplicationisinitiated.原核生物DNA分子中 AterminusisasegmentofDNAatwhichreplicationendsSagiv精英名校考 原核及真核细胞的 单 起始 终止Sagiv精英名校考 E.Sagiv精英名校考 一 的起Sagiv精英名校考 大肠杆菌GATC

TTTCTGGATAA TTtGGATAA R342RL 42RL2 6 8088

9260R

268R4AATAtGTGA AATAGGTGT13

9245bp图11-27E.coli 起点OriC的结构Sagiv精英名校考 起始区的结构特富含A－T，这可能和双链易于解开起始含有多个回文结构（9－14个GATC），8个GATC较保守，CATC中的“A”已甲基化;具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起GTTThttp:/ 13bpDNA 图11-28 涉及到系列蛋白的连续装配并导致DNA的解1英ti工作oQ/rproteinDnaASynthesisofDnaAiscoupledtogrowthratesothatinitiationofreplicationisalsocoupledtogrowthrate.DnaAformsacomplexof30-40molecules,facilitatingmeltingofthree13bpAT-richrepeatsequenceforDnaBbinding.DnaBisahelicasethatusetheenergyofDNAhydrolysistofurthermeltthedouble-strandedDNA.SSB(single-strandedbindingprotein)coatstheunwindedDNA.DNAprimaseloadtosynthesizesashortRNAprimerforsynthesisoftheleadingstrand.Primosome:DnaBhelicaseandDNASagiv精英名校考 表11-4在OriC上 蛋 功

结合于D