第7章-体液蛋白质检验

第七章体液蛋白质检测本章内容概要：第一节概述第二节血清总蛋白测定第三节血清清蛋白第四节血浆纤维蛋白原测定第五节血清黏蛋白测定第六节其他体液蛋白质测定第七节血清蛋白电泳分析一、血浆蛋白质的组成、功能及分类（一）血浆蛋白质的组成

血浆蛋白质是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90％左右，目前已经研究的血浆蛋白质有500多种，分离出的纯品物200来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成。蛋白质第一节概述

（二）血浆蛋白质的功能

1.营养作用

用于组织蛋白质的合成和氧化分解作用

2.维持血浆胶体渗透压

清蛋白（含量高、分子小）

3.运输功能

如清蛋白能与多种物质结合（FA、胆红素）

而某些球蛋白具特异地运输某些物质的功

能，运铁蛋白、运皮质醇蛋白

4.维持血浆正常pH

血浆蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一部分的弱酸盐形式存在，构成缓冲对

5.免疫功能

血浆中具有免疫功能的蛋白质是补体和抗体，抗体又称免疫球蛋白（Ig）如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。具有免疫作用的非特异球蛋白补体。

6.凝血与纤溶作用

凝血与纤溶是一对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器的动脉栓塞。

7.催化作用

血浆中有很多酶类，其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功能性酶，参与血浆生理作用。如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝蛋白、LPL、LCAT、肾素等。8.其他生理功能

合成组织蛋白或氧化供能、抑制蛋白水解。二、血浆蛋白质测定方法及评价（1）总蛋白测定的常见方法物理法：凯氏定氮法（参考方法）双缩脲法（常规方法）

酚试剂法电泳法紫外分光光度法化学法：染料结合法比浊法免疫化学法化学法

凯氏定氮法（参考方法）是测定蛋白质的经典方法，1883年Kjeldahl首创，精密度准确度高，但操作复杂、费时、技术性强，不适合临床常规检测，一般用于标准血清的标定和校正。双缩脲法原理：蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。双缩脲生成

加热＋NH322H－180022222N端C端此方法简便、准确，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。参考范围：成人60－80g/L临床意义：总蛋白升高：总蛋白降低：①丢失过多②消耗增加③白蛋白合成减少④水肿真性升高：巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高酚试剂法原理：蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物

Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。

比浊法原理：

评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）

某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。物理法电泳法：操作：醋酸纤维素薄膜电泳染色晾干透明光密度仪扫描洗脱比色染色分离测得蛋白组分百分比计算得出各种蛋白质含量半定量定量评价及应用：优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌．缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高紫外分光光度法

蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260

原理：评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。染料结合法(推荐)原理:

血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。染料溴甲酚绿BCG溴甲酚紫BCP优点缺点

易于和非人源性白蛋白结合

与白蛋白结合特异性较差

与白蛋白结合特异性好与非人源性白蛋白结合力弱4.免疫化学法原理及特点:应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.第二节血清总蛋白测定生化检验中测定蛋白质的方法很多，主要利用蛋白质的分子组成，结构或性质进行。方法：1.凯氏定氮法-参考方法2.双缩脲法-推荐3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6.UV法７.折光测定法实验目的熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）掌握血清总蛋白测定的临床意义进一步巩固掌握721型分光光度计的使用实验原理蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。

双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！

凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-

CONH2-）均可呈双缩脲反映。【试剂】（1）6mol/L氢氧化钠：溶解240g优质纯氢氧化钠于新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，稀释至1L，置聚乙烯瓶内盖紧保存。（2）双缩脲试剂：称取未风化没有丢失结晶水的硫酸铜（CuSO4·5H2O）3g，溶于500ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠9g，碘化钾5g，待完全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠100ml，并用蒸馏水稀释至1L。置聚乙烯瓶内盖紧保存。（3）双缩脲空白试剂：溶解酒石酸钾钠9g，碘化钾5g，于新鲜制备的蒸馏水中。加6mol/L氢氧化钠100ml，再加蒸馏水稀释至1L。（4）蛋白标准液：收集混合血清，用觊氏定氮法测定蛋白含量，亦可用定值参考血清或白蛋白标准血清。实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管标准管空白管待测血清0.1——蛋白质标准液—0.1—蒸馏水0.40.40.5双缩脲试剂3.0

3.0

3.0混匀，37℃水浴放置10分钟，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算

测定管吸光度血清总蛋白（g/L）=---------------------*蛋白质标准液浓度（g/L）

标准管吸光度标准曲线1.配制20g/L蛋白标准液2.取试管6支，标记后，按下表操作血清蛋白质标准曲线绘制操作步骤加入物（ml）空白管1234520g/L蛋白质标准液-0.10.20.30.40.5蒸馏水0.50.40.30.20.1-双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.0相当于血清蛋白质（g/L）020406080100注意事项：1.血清标本以新鲜为宜，含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现

混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色2.蛋白标准液要澄清，如果浑浊应更换，否则需作标准空白管，以消除浊度的影响。3.试管，刻度吸管应清洁，否则会有浑浊出现。4.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。5.铵离子能与氢氧化铜反应，因此，实验所用器材不可含铵盐。【临床意义】（一）血清总蛋白增高

1.血液浓缩

严重腹泻、呕吐、高烧

2.合成增加

主要见于球蛋白合成增加，多发性骨髓瘤。（二）血清总蛋白降低

1.

血液稀释

静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴留。

2.摄入不足和消耗增加

营养不良，慢性胃肠道疾病引起的

消化吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲亢、恶性肿瘤。

3.合成障碍

主要见于肝脏疾患。

4.蛋白质丢失

严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。第三节血清清蛋白测定血清清蛋白测定（溴甲酚绿法）【原理】溴甲酚绿（BCG）在pH4.2的环境中，在有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，可与清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一定范围内与清蛋白含量成正比。

注意：

BCG与清蛋白结合的特异性较低，它不仅与Alb结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中α1-球蛋白，TRF、Hp最明显，但反应速度不同，Alb可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。【试剂】1.10mmol/LBCG贮存液

BCG1.75g，溶于5ml1mol/LNaoH溶液中，加蒸馏水至250ml。2.0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH4.0）NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸馏水中，用1mol/LNaoH溶液调pH至4.10±0.05加蒸馏水至1L。3.叠氮钠贮存液

叠氮钠40g溶于1000ml蒸馏水中。4.聚氧乙烯月桂醚Brij-35溶液

Brij-3529g，加蒸馏水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。

5.BCG试剂

于IL容量瓶内加蒸馏水400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml，BCG贮存液8ml，叠氮钠贮存液2.5ml，Brij-35溶液2.5ml，加蒸馏水至刻度，配好的BCG试剂的pH应为4.15±0.05。

Brij-35可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，如无Brij-35可用吐温-20代替，叠氮钠有防腐作用。

6.清蛋白标准液实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管标准管空白管待测血清0.02——清白质标准液—0.02—蒸馏水----0.02BCG试剂4.04.0

4.0混匀，放置10分钟，以空白管调零点，在630nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算

测定管吸光度血清清蛋白（g/L）=------------------*清蛋白标准液浓度（g/L）

标准管吸光度血清球蛋白g/L=血清总蛋白g/L-血清清蛋白g/L参考范围血清清蛋白35-55g/L血清球蛋白

20-29g/L

2.临床意义

血清清蛋白（1）清蛋白浓度增高：除严重脱水，血浆浓缩而使清蛋白增高外，尚未发现单纯清蛋白浓度增高的疾病。（2）清蛋白浓度降低：同总蛋白浓度降低。

1.

血液稀释

静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴。

2.摄入不足和消耗增加

营养不良，慢性胃肠道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，结核

病、甲亢、恶性肿瘤。

3.合成障碍

主要见于肝脏疾患。

4.蛋白质丢失

严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。血清球蛋白

球蛋白的含量是通过血清总蛋白测定值减去血清清蛋白测值计算出的。临床意义球蛋白浓度增高：临床上球蛋白增高多见于炎症、免疫系统疾病和肿瘤1）细菌、病毒、寄生虫引起的急慢性感染：结核病、麻风病、疟疾、黑热病、血吸虫病、病毒性肝炎。2）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、风湿热、类风湿性关节炎等。3）多发性骨髓瘤和淋巴瘤：多发性骨髓瘤是一种单克隆疾病，它是由浆细胞恶性增殖造成的异常高的单一Ig（多见于IgA或IgG）血症。淋巴瘤也属单克隆疾病。球蛋白浓度降低：见于血液稀释、严重的营养不良、胃肠道疾病等。白蛋白与球蛋白的比例A／G比值反映了清蛋白与球蛋白浓度变化的关系。正常A／G比值为1～2／1.临床上常用A／G比值来衡量肝脏疾病的严重程度，当A／G比值小于1时，称比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一。第四节血浆纤维蛋白测定血浆纤维蛋白原测定

血浆纤维蛋白原（Fib）是一种参与血液凝固的糖蛋白，又称凝血因子Ⅰ，在肝脏合成，电泳时位于β球蛋白区带。血浆纤维蛋白原测定对于出血性疾病和肝脏损伤的诊断有重要意义。

复钙双缩脲法原理在稀释血浆中加入钙离子使纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块，将凝块分离后用双缩脲法测定纤维蛋白含量。

试剂1）225.2mmol/L氯化钙溶液：

2）154mmol/氯化钠溶液：

3）双缩脲空白试剂：

4）蛋白标准液：

注意事项1、标本要新鲜，放置过久会使结果偏低。2、纤维蛋白凝块要完全卷起。3、不能溶血，否则结果增高。4、卷、挤、吸、洗、溶的过程要轻柔，避免纤维蛋白丢失。

测定管吸光度0.01血清总蛋白（g/L）=----------------*标准蛋白质浓度（g/L）*----

标准管吸光度0.5参考范围2-4g/L二、热沉淀比浊法

原理

血浆经

pH6.3

KH2PO4-NaOH缓冲液稀释后，加热至56℃，使纤维蛋白原凝集而呈现浊度，而其它蛋白质仍处于溶解状态，用比浊法测定其含量。热沉淀比浊法试剂

0.1mol/LKH2PO40.1mol/LNaOHKH2PO4-NaOH缓冲液1.纤维蛋白原减少1.原发性纤维蛋白原减少为罕见的遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝脏不能合成纤维蛋白原。男、女两性均能发生，但以男婴为多见，患婴出生时，半数出现脐带出血。血液凝固缓慢.

2.继发性血浆纤维蛋白原减少由于纤维蛋白溶解酶溶解纤维蛋白所致。如胎盘早剥，分娩时羊水进入血管形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶酶原，使血中纤维蛋白溶酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗了体内原有的纤维蛋白原，使其含量减少。有时可降至0.5g／L以下。3.严重的肝实质损害如各种原因引起的肝坏死、慢性肝病晚期、肝硬化等都可出现纤维蛋白原的减少。此类疾病还常伴有凝血酶原及第七因子缺乏，往往是病情严重的先兆。此外，严重的低纤维蛋白原血症也可见于肺及前列腺手术中。2.纤维蛋白原增加纤维蛋白原是一种急性时相蛋白，其增加往往是机体的一种非特异反应，常见于下列疾病：（1）感染：如毒血症、肺炎、轻型肝炎、胆囊炎、肺结核及长期的局部炎症等。（2）无菌炎症：如肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、风湿性关节炎等。

（3）其他：如外科手术、放射治疗、月经期及妊娠也可轻度增高。

3.纤维蛋白原异常纤维蛋白原异常是一种遗传性疾病，是常染色体显性遗传。患者纤维蛋白原含量可能在正常范围，但纤维蛋白原有质的异常。主要是纤维蛋白原分子的一个多肽上出现了一个异常的氨基酸，临床上可无症状或仅有轻度的出血倾向。第五节血清黏蛋白白测定血清粘蛋白血清粘蛋白占血清总蛋白量的1%～2%，是体内一种粘多糖与蛋白质分子结合成的耐热复合蛋白质.属于体内糖蛋白的一种.其粘多糖往往是由氨基葡萄糖、氨基半乳糖、甘露糖、岩藻糖及唾液酸等组成。酚试剂法酚试剂与粘蛋白分子中的酪氨酸残基作用,生成蓝色化合物.试剂154mmol/L氯化钠溶液1.8mmol/L过氯酸溶液17.74mmol/L磷钨酸溶液酚试剂1.88mmol/L碳酸钠溶液酪氨酸标准溶液实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管标准管空白管蒸馏水1.751.51.75酪氨酸标准溶液—0.25—碳酸钠溶液0.500.500.50酚试剂0.250.250.25混匀，37℃水浴放置15分钟，以空白管调零点，在650nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。参考范围:0.71~0.87g/L注意事项过氯酸为强氧化剂,按危险品保存,实验操作时多加小心.临床意义

血清粘蛋白增高常见于各种急性或慢性炎症,病理性增生,组织破坏等如肿瘤（尤其是女性生殖器肿瘤）、结核、肺炎、系统性红斑狼疮、风湿热、风湿性关节炎等

血清粘蛋白减少常见于实质性肝病(如病毒性肝炎/中毒性肝炎/门静脉肝硬化等),甲状腺功能减退,肾病综合症.血清粘蛋白的连续测定对于同一病例病程的转归（病变的扩大或缩小、肿瘤有无转移、肿瘤手术切除或其他治疗效果）的判断有一定的参考价值。第六节其他体液蛋白质测定脑脊液蛋白质测定脑脊液蛋白质来源:外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的内源:由中枢神经系统合成的脑脊液特有蛋白质.检测方法1.磺基水杨酸-硫酸钠比浊(SS-S)法2.邻苯三酚红钼络合显色法目的对改良的磺基水杨酸-硫酸钠比浊(SS-S)法测定脑脊液蛋白进行评价,选择一种快速、准确、低廉、适合临床常规检验的方法。试剂磺基水杨酸-硫酸钠溶液叠氮钠生理盐水蛋白质标准液实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管标准管空白管脑脊液0.5----蛋白质标准溶液—0.5—生理盐水----0.5磺基水杨酸-硫酸钠溶液4.04.04.0实验操作混匀，37℃水浴放置10分钟，以空白管调零点，在530nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。

测定管吸光度脑脊液总蛋白质（g/L）=----------------*标准蛋白质浓度（g/L）标准管吸光度参考范围新生儿400~1200mg/L儿童200~700mg/L成人150~400mg/L临床意义临床情况外观总蛋白(mg-L)

健康成年人无色、透明、澄清150～450球菌性脑膜炎脓性、混浊1000～30000结核性脑膜炎无色、纤维薄膜500～3000，偶可达10000病毒性脑膜炎无色、清500～3000癫痫无色、清500～3000脊髓肿瘤无色、清、黄变1000～20000脑瘤无色、清150～2000脑脓肿清或微混300～3000脑出血无色、黄变或血性300～1500多发性硬化症无色、清250～800尿总蛋白测定来源：２／３来自血浆蛋白，主要是ＡＬＢ１／３来自肾脏与尿路的组织蛋白。临床应用：正常儿童＜40mg／24h，成30mg－130mg/24h；异常：蛋白尿。检测：用于泌尿系统疾病及一些全身性疾病的筛查、疗效观察，详见肾脏功能检验。检测方法:1、浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠沉淀比浊（受温度等影响）H+2、邻苯三酚红钼络合显色法正电负电3、双缩脲比色法试剂1.显色试剂邻苯三酚红钼酸铵2.蛋白质标准液实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管标准管空白管生理盐水----0.1蛋白质标准溶液—0.1—标本0.1----显色试剂5.05.05.0实验操作混匀，37℃水浴放置10分钟，以空白管调零点，在600nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。

测定管吸光度尿蛋白（g/L）=----------------*标准蛋白质浓度（g/L）标准管吸光度参考范围随机蛋白质10~140mg/L24H尿蛋白28~141mg/24H临床意义生理性蛋白尿高蛋白饮食、剧烈运动、发热、寒冷、精神过度紧张所导致的轻度、一过性蛋白尿。病理性蛋白尿肾小球、肾小管疾病所致的蛋白尿。1.肾小球性蛋白尿:急性肾小球性肾炎、急性肾功能衰竭、红斑狼疮性肾病等2.肾小管性蛋白尿:肾小管性酸中毒、肾盂肾炎、药物中毒等3.混合型蛋白尿：慢性肾炎、慢性肾盂肾炎以及糖尿病、系统性红包狼疮等全身性疾病等第七节血清蛋白电泳分析醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。实验原理带电粒子在电场作用下，向着与其所带电荷相反的方向泳动现象称为电泳。由于被分离物质各组分所带电荷的性质、数量和分子颗粒的大小、形状的不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（μ）不同，因此，经过一定时间电泳后即可被分离开来。电泳法及其影响因素利用上述性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。电泳法应用十分广泛，是生物科学中非常重要的一门研究技术。影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。

电泳法及其影响因素采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小，该法具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。

三、实验材料

醋酸纤维薄膜（2×8cm）常压电泳仪点样器（盖玻片）培养皿粗滤纸载玻片镊子人血清巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）染色液（氨基黑10B）漂洗液四、实验步骤

1.浸泡：

将2×8cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5cm