脂肪干细胞的体外培养

脂肪干细胞基础与临床

干细胞（Stemcell，SC）：干细胞（Stemcell，SC）是有自我复制、高度增殖和多向化潜能的细胞群体，这些细胞以通过细胞分裂维持自身细胞的大小，同时又可以进一步分成为各种不同的组织细胞，从构成机体各种复杂的组织器官。

干细胞技术:又称为再生医疗技术，是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。干细胞是整个人体生长发育的基础“材料”。

干细胞生物学特性脂肪干细胞生物学特性2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点，目前脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中的含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。

脂肪来源干细胞脂肪来源干细胞脂肪来源干细胞的命名

脂肪来源干细胞(Adipose

Derived

Stem

Cell,

ADSC)脂肪来源间充质干细胞(Adipose

Derived

MsenchymalStem

Cell,

AD-MSC(ASC))脂肪来源血管基质成分(StromalVascularFraction,SVF)富含大量的CD34+细胞,从脂肪组织直接获得富含一定量的CD34+细胞,SVF培养P0-P2不富含CD34+细胞,SVF培养P2之后脂肪干细胞的鉴定在缺少分化刺激因子的条件下，ASC表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、CD166；经过14d的诱导培养后,ASC虽然发生了形态变化，表现出成脂细胞、成软骨细胞、成骨细胞等分化的特征，但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致，这些表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105，均不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子和受体分子，但两者仍有区别。ASC表达CD49d，而不表达CD106，BMSC则相反，造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。

脂肪干细胞的表面标记

a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)；细胞间粘附分子1(ICAM1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(Eselectin，CD62)；b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体；c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)；d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达造血细胞标志物CD14、CD31或CD45；f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白；g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。不同的试验结果结果有不同，但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正化方法不同，以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的来说，PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。脂肪干细胞的体外培养

脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2×108～6×108

个这样的细胞。

体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培养基。一般只添加体积分数为10％的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。在传代培养中，平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5％细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15％，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。

脂肪干细胞成脂分化ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，长期培养仍可维持此种分化能力。脂肪细胞分化过程大致如下：（1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞（此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂肪细胞。目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激，如寒冷、激素、生物活性因子、体外实验性诱导剂刺激后，由多能变为单能定向分化的起始阶段。前脂肪细胞的增殖与分化的关系为：生长停顿—生长再续—细胞分化。其中生长停顿是必要的第一步，由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、营养因子缺乏引起。脂肪干细胞成脂分化目前已鉴定出的对前脂肪细胞增殖和分化有直接影响的转录因子主要有：过氧化物酶增殖体（PPARs）——在前脂肪细胞的成脂分化中起主要调控作用；CCAT增强子结合蛋白（C／EBP）与ADD-1——可启动和维持前脂肪细胞向脂肪方向分化，PPARs与配体结合激活脂肪发育过程中关键基因的转录；脂肪酸转运蛋白(FA)、类胰岛素生长因子-1（IGF-1)及其受体在此阶段也有表达。脂肪干细胞成脂分化脂肪细胞分化过程中，其细胞形态、膜表面蛋白、胞质内容物和基因表达均发生了极大的改变。可以根据这些变化来判定脂肪细胞的分化状态。(1)细胞形态。脂肪细胞贴壁后最初为小圆形，核／浆比例增大，4d后即可观察到细胞渐成梭形，7d后梭形细胞扩大增殖，开始积聚脂肪颗粒，9d时可观察到细胞由梭形渐变成椭圆形，积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到2周时分化成多脂滴或单脂滴的细胞。(2)脂肪细胞内的脂肪含量。对前脂肪细胞分化结果的定性研究一般采用油红O或甲烯兰染色，一般来说，前脂肪细胞在培养的前3d即开始有脂肪的积聚，1周后积聚量明显增高，2周后达到高峰。(3)脂肪细胞分化不同时期的标志物。细胞开始分化后，随时间的推移出现PobmRNA以及LPLmRNA这两种转化早期的标志物，其中前者是体内及体外脂肪状态的独特标志物，此时如果外界条件改变，解除了这种生长停顿，则前脂肪细胞的早期标志物消失，重新出现生长和增殖，DNA合成增加。否则，将出现磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物，并最终变成脂肪细胞。除了上述分化标志外，脂肪细胞在分化过程中还表达其他的标志物，如早期标志物FAtransport，中期标志物FAS、HSL、ACC、aP2、GPAT、GDPH，晚期标志物ACBP、Leptin。可以用PCR技术检测这些物质的mRNA来判断脂肪细胞的分化阶段。

目前，将脂肪干细胞应用于脂肪组织工程的研究刚刚兴起，研究还都处于细胞和实验动物阶段，还没有体外构建的脂肪组织在体内稳定长期存在的报道。

当前，脂肪干细胞应用于脂肪组织工程主要有两种方式：⑴用脂肪干细胞体外扩增一定量的细胞数后结合适当的支架材料和一定的生物活性物质应用于患者；⑵用脂肪干细胞体外构建脂肪组织后移植。有研究者利用脂肪生成所需的环境和细胞因子吸引、招募和趋化周围的脂肪干细胞，在原位诱导分化成脂肪组织。举例：Kimura等将Matrigel凝胶和FGF-2细胞生长因子一起注射到大鼠的皮下组织，以吸引邻近的结缔组织中脂肪干细胞迁移过来形成新的脂肪组织，但仅有微小的脂肪组织生成。Cho等将改进性能的PLGA支架材料做成中空的圆顶状，移植入裸鼠的皮下，随后将包被有脂肪干细胞的纤维蛋白凝胶注射于其中，6周后发现有脂肪组织形成，而且支架结构完好稳定。但目前尚未发现脂肪组织存活更长时间的实验报道。究其原因，可能是脂肪干细胞的数量、支持材料的生物相容性和促进脂肪细胞生成的微环境影响了工程化脂肪组织的长期稳定存在。——种子细胞数量不足！脂肪干细胞的应用脂肪来源干细胞临床实验

(1)脂肪干细胞虽然可以在诱导下向脂肪组织分化，但目前诱导分化的机制尚不清楚。(2)研究发现，来自于不同个体、不同部位的脂肪干细胞的分化能力有明显差别，其具体原因尚不清楚，但却为进一步探寻脂肪干细胞在体外诱导分化的条件和最佳供体、供区提供了新的课题。(3)体外培养的脂肪干细胞最终要移入体内进行研究，然而用人体来做实验是不可能的，所以必须建立动物模型。(4)种子细胞最后移入体内还需要有合适的载体（即生物材料），目前关于生物材料的研究较少，所以特异性组织生物材料也将是一个重要而广阔的研究领域。

脂肪干细胞研究存在问题及展望脂肪干细胞临床应用优越性ASC与其它来源干细胞相比有显著的优越性：脂肪是人体来源最丰富的组织。相对于人体其它组织，脂肪干细胞更易于通过脂肪抽吸术等方式大量获得，患者的痛苦小，不会对人体产生明显的生物学和解剖学不良后果。研究发现250～500mL脂肪抽吸组织可产生超过108个细胞。来自自体，具备免疫相容性，不会产生排斥反应和伦理学问题。与骨髓干细胞不同,脂肪干细胞的生长和增殖不需要特殊血清，并且在体外增殖速度快，不必进行永生化处理就能获得足够的细胞用于移植，这为临床移植提供了充足的细胞来源。因此，脂肪干细胞具有用于脂肪组织工程所需细胞的理想特性。以脂肪干细胞作为种子细胞的脂肪组织工程有望在乳房再造术、除皱术及凹陷畸形矫正术中发挥作用。不同部位成体干细胞来源

优点

缺点骨髓来源间充质干细胞(BMSC)

自体应用无免疫排斥反应获取细胞对病人造成的痛苦大,来源于自体（来源受限）,被感染等不安全因素；细胞相对扩增能力与患者的年龄有关，越小越好；脂肪来源间充质干细胞(ADSC)

自体应用无免疫排斥反应获取细胞对病人造成的痛苦大,来源于自体（来源受限）,被感染等不安全因素；血液来源间充质干细胞(PBMSC)采集安全,对病人造成痛苦少，来源广泛（血液干细胞库）含量少，临床应用受限；细胞扩增能力较差；脐带来源间充质干细胞（HUMSC）

来源广泛；对于病人造成的痛苦少；建立生命银行（干细胞库）；细胞的扩增能力强；研究的历史比较短几种间充质干细胞的比较20世纪初，自体颗粒脂肪移植开始应用于临床，由于其吸收率高、存活率低，且并发症较多，限制了其在临床中的应用。21世纪初，通过改进脂肪获取技术，加速了脂肪血管化，提高了脂肪颗粒移植的成活率。但是坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。1998年，Coleman发明了结构脂肪（liposuction）移植技术，即在脂肪移植的整个过程中保证脂肪细胞具有更多的完整性和活性，也就是后来所说的Coleman技术，使脂肪移植的存活率有了很大的提高。近年来，随着组织工程技术的迅速发展，为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题，如吸收、囊肿、硬结等，Yoshimura等又发明了细胞辅助的脂肪移植术（cell-assistedlipotransfer，CAL），为脂肪移植提供了一种更为可靠的方法。该技术是将自体脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells，ASCs）与脂肪细胞混合，联合注射移植。脂肪来源干细胞用于医学美容细胞辅助的脂肪移植术-理论基础细胞辅助的脂肪移植术的理论基础1)ASCscandifferentiateintovascularendothelialcellsthatmaycontributetoneoangiogenesisduringthehealingprocessaftertransplantation.Thiseffectmaycontributetothedecreased

amountofcentralnecrosisandmarkedmicrovasculatureintheouterlayersofCALfatseeninthisstudy.2)someASCsmaydifferentiateintomatureadipocytes

andpartlyconstitutetransplantedfat.3)ASCsreleaseangiogenicsolublefactorssuchasvascularendothelial

growthfactorandhepatocytegrowthfactor,accelerating

neoangiogenesisfromthesurroundinghosttissueina

paracrinemanner.间质血管碎片是CAL最重要的组分ASCs存在于脂肪组织的间质血管碎片中（stromalvascularfraction,SVF）。间质血管碎片（SVF）是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化，从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片（SVF）。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞，可分化为多种谱系的细胞，是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞。其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外，SVF中也包括一些血管来源的细胞，如白细胞和红细胞等，而血管来源细胞的比率主要取决于个体出血的多少。在CAL中，不需经过人工的分选及培养，直接将分离的新鲜的自体SVF用来做脂肪移植补充物。另外，有研究指出新鲜分离的脂肪干细胞与培养增殖的干细胞相比可能在治疗方面更具有安全性和有效性。因为SVF包含其他细胞，如血管内皮细胞或巨噬细胞等，许多研究发现它们之间有一种协同效应。

ASCs在脂肪移植中的作用脂肪移植后脂肪组织的存活和萎缩的机制并未得到证明。移植后无微血管的脂肪组织被安置于异位组织中—相对缺血区，最初几天的营养灌注来自于宿主组织周围组织，直到形成新的微血管。对于损伤的反应，损伤的宿主组织，特别是细胞外基质和死亡的细胞会释放FGF。在修复过程中，脂肪细胞（对缺氧很敏感）在氧压低于其阈值的情况下24h内可能死亡。ASCs更能耐受缺氧，其在缺氧情况下可保持功能72h。在动物模型的缺血再灌注损伤的脂肪组织中，ASCs在脂肪移植的修复过程中及在脂肪化和血管化中起着重要的作用其可调节周围组织中生长激素及细胞因子的释放，并通过分泌各种生长因子如VEGF,IGF-1防止细胞凋亡，使脂肪组织的再生和凋亡达到平衡。ASCs被认为是一种脂肪细胞和血管细胞的双重祖细胞。ASCs可为脂肪组织的转归和下一代的再生提供原始细胞，脂肪组织细胞凋亡后可被ASCs来源的下一代细胞取代。脂肪组织会随着发育、肥胖而增殖，也会随着老龄化、缺血而发生萎缩，还可在损伤后修复、缺血再灌注的损伤及脂肪移植后起到塑形作用。CAL技术简介CAL技术简介ASCs在细胞辅助的脂肪移植术（CAL）中的作用CAL技术是将新抽取脂肪分成两份:一份用来提取SVF，另一份作为提取的细胞外基质，两部分联合提高ASCs浓度，注射于受区。吸脂的脂肪组织与完整脂肪组织相比，ASCs的数量只有原来的一半。其原因可能是因为一部分ASCs停留在大血管周围或留在受体组织中，一部分ASCs释放入吸脂脂肪的液体成分中。这种低ASCs比率可能是移植的脂肪组织长时间后萎缩的主要原因。在CAL中，脂肪组织可作为有活力的生物支架，使新鲜的包含ASCs的SVF粘附于脂肪组织上，不仅增加了前体细胞的数量，还有利于组织血管的形成和ASCs向脂肪组织的转归，提高了脂肪组织的成活率。Yoshimura认为ASCs在CAL中的作用可能是：①分化成脂肪细胞并促进脂肪再生；②代替内皮祖细胞分化成血管内皮细胞和壁细胞，，加速移植脂肪的血管化和再成活；③在缺氧、损伤等条件下可促进血管生长因子释放，如肝细胞生长因子（HGF）,基质细胞衍生因子-1(SDF-1)；④最有可能的就是ASCs作为原始的ASCs而成活。多位点微剂量注射技术抽取脂肪在无菌手术室中进行（surgicalunit，SU），两个细胞无菌处理室连接在一起（cellprocessingandsurgicalunit，CPSU），同时进行。将上述高浓度干细胞与脂肪混合物，均匀注入乳房后间隙和皮下脂肪中，可增大乳房每侧１００～２００ｍｌ，最大可达２７０ｍ