《黑木耳多糖提取方法问题研究6000字（论文）》

黑木耳多糖提取方法的研究报告摘要多糖(Polysaccharides)与蛋白质、核酸一样是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一。多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，又称为多聚糖。多糖不仅是人体生命必需的成分，而且存在于一切细胞膜结构中，并参与多种生命活动。多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而成的聚合度超过10的高聚物。天然提取的多糖来源广泛且性质温和，是高等植物、动物、微生物细胞中一类非常重要的大分子物质。国内外研究表明，多糖具有抗病毒、抗炎症、抗放射、抗凝血等功效，活性多糖是理想的新型免疫药剂，它的特点是对人体的毒性小，通过强化特异性或非特异性免疫功能，从而增强人体本身防御机制，即提高人体免疫力。人体观察实验表明黑木耳具有明显的降血脂和抗血栓形成以及抑制血小板聚集等作用，具有非常好的提高免疫力、抗氧化等保健作用和药用价值，尤其是针对老年人群体，有着降血压、血脂的功效。而现阶段的提取方法对黑木耳多糖的提取率不高，本文将采用超声波协助微波的方法提取黑木耳中的多糖成分，为以后的研究作以借鉴。关键词：黑木耳；多糖；提取方法；超声波-微波复合提取引言近年来，随着生活水平的逐渐提高，人们对健康越来越重视，现阶段医学的发展对出生率、婴幼儿的疾病治疗已经得到了非常好的控制，而中老年人的慢性疾病往往难以根治，容易复发，越来越多的人患有溃疡、衰老、肝炎、糖尿病甚至癌症等病情，故此人们对于保健也越来越关注。而研究发现黑木耳中的多糖具有效缓解这些症状的功能，并有增强人们的生理活性的医疗保健作用，天然产物中的多糖可以清除自由基，抑制亚油酸氧化、抑制脂质过氧化等功效，在医学药用价值上有着调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老等作用效果，对于中老年人群体有着非常好的保健作用。黑木耳多糖具有多种生物功能，目前已经利用黑木耳多糖开发功能性食品添加剂、保健品、药品，具有广阔的开发前景，但由于提取率还较低，不能充分利用黑木耳，还没有较为统一的高效提取方法，但研发出有益于人类身体健康、经济效益高的黑木耳深加工产品还不相对足。故此对于多糖的研究也越来越热门化。多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。由相同的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。从古到今，真菌因其味道鲜美、营养丰富而被人们作为传统食物所食用，部分真菌还被用作药用。其中多糖作为重要的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖等功效。由于真菌多糖所具有的多种功效及毒副作用小等优点，现已被广泛应用于食品、药学、医学、化妆品等领域。黑木耳作为真菌中的一种在我国的资源非常丰富，约占世界含量的90%，大多分布在东北平原一带，例如吉林、黑龙江等地，别名云耳、木菌等，其味道鲜美、口感较好、营养丰富，被誉为“中餐中的黑色瑰宝”、“素中之荤”、“菌中之冠”，其中含有人体必须的8种维生素和氨基酸，此外，还富含多糖物质。是我国珍贵的药用和食用胶质真菌，养血驻颜，祛病延年。多糖为黑木耳的重要活性成分，它具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用，还具有降低血脂、胆固醇、血液黏度、抗血栓形成、降低血糖、抗糖尿病、抗衰老等作用。随着人民生活水平的提高，高血脂、高胆固醇患者越来越多，于是黑木耳成为人们关注的焦点。但由于黑木耳细胞壁关键组分几丁质和β-葡聚糖质地坚韧，不易被人体所消化、吸收，因此，提取黑木耳多糖直接供人类食用成为必需。另外，随着对黑木耳多糖研究的不断深入，利用黑木耳多糖开发的功能性食品添加剂、保健品或药品的市场前景为人们所关注。因此，提高黑木耳多糖提取得率及纯化黑木耳多糖的研究具有重要意义。人们对黑木耳中的多糖提取工艺一直在不断优化，现阶段的黑木耳多糖提取方法有热水浸提法、酶解法、酸碱提取法、超声波提取法和微波提取法等，方法与方法之间耗时以及提取率都存在较大的差异，传统的热水法往往多糖难以释放，会导致多糖的得率较低，就目前研究来看，热水浸提法的多糖的率可达8.41%，超声波提取法的得率为15%左右，而在李超等采用微波提取法的优化实验中，得率可高达18%~20%左右，优化的效果较为理想，其实验中对一定量水浸润的干料进行微波处理并进行水润浸提，破壁的效果会更佳，而超声波-微波的复合提取方法相比热水法可以最大限度的将真菌组织分解，不仅大大节约了时间提高了多糖得率，同时减少了多糖结构及生物活性的破坏，节省了水浴、除蛋白、浓缩等过程能源和试剂的消耗，优越性显著。超声波-微波提取法具有设备简单、适用范围广、提取率高、节省溶剂、节省时间、节能、不产生噪音和污染等众多优点。是一种颇具发展潜力的新型辅助提取技术。该提取方法反应时间短、反应条件温和、细胞破壁彻底、粗多糖溶出率高。随着对黑木耳多糖研究的不断深入。其营养价值和生物活性为人们所看好。若能够确定黑木耳多糖的最佳提取工艺，便能提高黑木耳的多糖提取效率，降低黑木耳多糖的开发成本及损耗，由此获得杂质更少纯度更高的黑木耳多糖，为人类的健康和安全提供更为有利的帮助。2.材料和仪器2.1材料和试剂黑木耳（购买于万德福超市）、葡萄糖、苯酚、98%浓硫酸、无水乙醇、乙醚、正丁醇、氯仿、双氧水、盐酸标准溶液、DNS（3,5-二硝基对氨基苯磺酸）、酚酞试剂等。（以上试剂均为分析纯）2.2仪器与设备烘箱：中国重庆试验设备厂；FW177型粉碎机：天津市秦特仪器有限责任公司；TDL-4型离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-250DB型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；721型分光光度计：上海精密科学仪器有限责任公司；GR-200电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HH-系列恒温水浴锅：黄骅市渤海电器厂；MG-5530S格兰仕微波炉：广东顺德格兰仕电器有限公司；等。3.试验方法2.1黑木耳多糖的提取方法取干木耳用温水浸泡洗净后烘干至恒重，进行机械粉碎，称取黑木耳粉末以一定的料液比浸泡，超声波50kHZ辅助破壁20min，采用微波辅助提取，水浴浸提、离心。取上清液减压浓缩，醇沉，再次离心。沉淀依次采用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得到黑木耳多糖粗品。然后加入3倍体积95%的乙醇溶液，放入冰箱静置10h，取出后离心，去取沉淀冷冻干燥，得到黑木耳多糖精品。2.2黑木耳多糖的测定方法采用苯酚-硫酸法测定黑木耳多糖的含量2.3标准曲线的绘制精密称取标准葡萄糖20mg放入500ml容量瓶中，加水至刻度，即为葡萄糖标准溶液，分别吸取0.4、0.6、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml的葡萄糖标准溶液，各加以蒸馏水补至2.0ml，并单独取2.0ml的蒸馏水作为空白，然后在各个样品中加入1ml的6%的苯酚和5ml浓硫酸，静置10min后摇匀，室温下放置20min，于490nm处测量各个样品的吸光值，以多糖浓度（mg/L）为横坐标，以吸收值为纵坐标绘制标准曲线。表1标准曲线的绘制__________________________________________________________________________________标签号多糖浓度/(mg/L)吸收值______1002170.113250.164380.235450.266520.317620.378710.43___9780.47_______图1葡萄糖标准曲线回归方程为A=0.0059B+0.0037R2=0.9986式中A为吸收值，B为葡萄糖浓度（m2.4计算公式根据下列公式计算黑木耳多糖得率黑木耳多糖得率=c×V×N式中：c为有标准曲线算的多糖质量浓度，mg/mL；V为定容体积，ml；N为稀释倍数；m为黑木耳的干粉质量，g。4.实验设计4.1单因素实验设计4.1.1微波功率对多糖提取率的影响精确称取1g黑木耳粉末，以料液比1:130并以50kHZ超声波浸泡处理20min，分别在功率400、450、500、550、600W下微波提取5min后，100℃水浴浸提2h，离心后分别取上清液测定多糖含量。4.1.2提取温度对多糖提取率的影响精确称取1g黑木耳粉末，以料液比1:130并以50kHZ超声波浸泡处理20min，在微波功率550W下提取5min，分别在20,40,60,80,100℃的水浴中浸提2h，离心后分别取上清液测定多糖含量。4.1.3微波作用的时间对多糖提取率的影响精确称取1g黑木耳粉末，以料液比1:130并以50kHZ超声波浸泡处理20min，在微波功率550W下分别处理1、3、5、7、9min提取，100℃水浴浸提2h，离心后分别取上清液测定多糖含量。4.1.4料液比对多糖提取率的影响精确称取1g黑木耳粉末，分别以50,100，150,200,250的液料比以50kHZ超声波浸泡处理20min，在微波功率550W下提取5min，100℃水浴浸提2h，离心后分别取上清液测定多糖含量。4.2正交试验设计在单因素试验的基础上，选取料液比、微波时间、水浴温度三个因素，采用L3表2正交试验因素水平表.________________________________因素________________________________水平A料液比/（g/mL）B微波功率_____C微波时间/min_____11:130540421:150560531:1705806___________5.数据处理与分析5.1单因素试验的数据分析5.1.1微波功率对多糖提取率的影响由功率对提取率的影响试验数据如图2图2微波功率对黑木耳多糖得率的影响由图2可知当微波功率在400W~550w之间时，黑木耳中多糖的提取率会随着微波功率的提高而缓慢增加，由400W时15.53%的提取率升高到550W时17.36%的提取率，当功率超过550w时，提取率呈下降趋势，600W时的提取率为16.24%，相比550W时的多糖提取率下降了1.12%。5.1.2提取温度对多糖提取率的影响由提取温度对提取率影响的实验数据如图3如图所示，水浴浸提的温度从20℃到100℃，黑木耳中多糖的提取率随着温度的增加而稳步明显的提升，由20℃的12.35%提升到100℃的20.03%，增加了7.68%的多糖得率，这是因为随着温度的升高，多糖的溶解率也会不断提高，溶解率的提高使得多糖不断从胞内溶出，进而扩散到溶剂中，提高多糖提取得率。图3提取温度对黑木耳多糖提取率的影响5.1.3微波作用时间对多糖提取率的影响由微波时间对多糖提取得率的影响实验结果如下图4所示图4微波时间对多糖提取得率的影响微波的作用时间在1~5min之间，黑木耳中多糖的提取得率会随着微波时间加长而缓慢上升，1min时为17.02%，微波作用5min可以增加到21.44%，多出了4.42%多糖提取得率。而5min以后多糖的提取的率不再增长，时间过长会有所下降。这主要是因为原料已经经过超声波的机械粉碎预处理，微波辅助提取黑木耳中多糖的原理是将一定频率的电磁波作用于木耳的细胞，细胞会吸收电磁波的能量，细胞温度会随着能量的吸收不断上升，使得细胞压力增大，进而破裂，多糖从胞内溶出。而在超声波的预处理下，一部分细胞已经破裂，剩余细胞在电磁波的作用下也逐渐破裂，超出固定时间就再没有多糖的溶出，随着胞内其他物质的流出反而会影响多糖的提取，故此选择微波作用时间5min为宜。5.1.4料液比对多糖提取率的影响不同的料液比对多糖提取得率的影响试验数据如图5图5液料比对多糖得出率的影响如图5可知，在液料比小于1:150（g/mL）时多糖的提取得率会随着溶剂的增加而上升，即由1:50（g/mL）时8.24%一直增加到16.38%，增加了8.14%的多糖提取得率，而料液比大于1:150（g/mL）时多糖的提取得率的趋势趋于平缓，会略微下降。分析其原因主要是因为当溶剂量过少的时候，黑木耳粉末颗粒不能够完全地分散，浓度过高也会不利于多糖的溶出；而当溶剂量增加时，黑木耳粉颗粒得以完全分散，多糖更容易扩散和溶出，多糖的提取得率就会提高；但当液料比过高，一方面使得浓缩的时间过长，另一方面多糖的结构容易被破坏，故此会导致多糖得率有所下降，而且由于多余的溶剂会吸收更多的微波能量，也会导致细胞破裂不充分，故此料液比选择在1：100~1:150（g/mL）之间为宜。5.2正交试验的数据分析表2正交试验结果和数据分析_________________________因素_________________________黑木耳多糖__试验号___________A__________________B____________________C________提取得率/%11116.8121226.8931336.1542126.9352235.8662315.1373136.3083215.3493326.73K119.8520.0417.28K217.9218.0920.55K318.3718.0118.31k16.626.685.76k25.976.036.85k36.126.006.10R0.640.681.09由表2数据分析结果可知，微波作用时间对黑木耳多糖提取得率影响最大，其次是微波功率，料水比影响较小，各因素的影响大小顺序为微波时间＞微波功率＞料水比，最优组合为C26.结论：本实验采用超声波-微波的复合方法提取黑木耳中多糖，采用的仪器和设备都比较方便，在生产中具有安全、快速、节能、提取得率高且节能易放大等优点，大大缩短了生产时间。超声波预处理的效果非常显著，一方面大大减少了物料浸泡的时间，另一方面还能达到一定的破壁效果，使得微波的处理能够充分释放胞内的多糖。其次，超声的预处理中溶剂不宜过多，会消耗多余的能量，可先加入一部分溶剂进行超声波预处理，达到一定的机械破壁效果即可，胞内多糖的释放可以在微波处理，水浴浸提时同步进行，这样既有节能的效果，又能保证较高的多糖提取得率。最后，提取工艺不同，对多糖的结构、生理活性等影响各有不同，要达到可食用的标准，对超声波、微波等对黑木耳中多糖的生理活性、空间结构及组成是否会产生一定的影响，仍有待及研究。参考文献[1]张秀娟,曲中原.黑木耳多糖理学研究进展[J].中国微生态学杂志,2003,15(6):373.[2]谢明勇,聂少平.天然产物活性多糖结构与功能研究进展[J].中国食品学报,2010,10(2):1-11.[3]郑贱仙.功能性食品[J].中国轻工业出版社,1999,09(01):75-82.[4]林树钱,天麻.中国药用菌生产与产品开发[J].中国农业出版社,2009,25(5):74-80.[5]刘春延.富硒黑木耳硒多糖提取纯化及抗氧化活性的研究[J].东北林业大学,2017,57(02):20-21.[6]Kubokn,Nanbah.Anti-hyperliposiseffectofmaitakefruitbody(Grifolafrondosa)[J].IBiolPharmBull,1997,20(7):781-785．[7]赵希艳,贾凌杉,马华.微波辅助提取黑木耳多糖工艺[J].河北科技师范学院学报,2012,26(01):65-67.[8]何照范,张迪清.保健食品化学及其检测技术[J].食品化学,2016,42(5):22-25.[9]Xuhong-xi,leeSpencerHS,LeeSongFLee,etal.Isolationandcharacterizationofananti-HSVpolysaccharidefromPrunella6ulgaris[J].Antiviralresearch,1999,44:43-54.[10]Song,LJ.IridoidglycosidesfromtheflowerbudsofLonicerajaponicaandtheirnitricoxideproductionandα-glucosidaseinhibitoryactivities[J].FunctFoods,2015,18(1),512-519.[11]范亚明.黑木耳抗脂质过氧化的初步探讨[J].心血管病杂志,1995,14(4):236-238.[12]吴宪瑞,孔令员.黑木耳多糖的医疗保健价值[J].林业科技,1996,21(3):32-33.[13]RezaMA,JoWS,ParkSC.Comparativeantitumoractivityofjellyearculinary-medicinalmushroom,Auriculariaauricula-judae(Bull)[J].Schrot.(higherbasidiomycetes)extractsagainsttumorcellsinvitro[J].IntJMedMushrooms,2012,14(4):403-409.[14]宗灿华,于国萍.黑木耳多糖抑制肿瘤作用的研究[J].中国医疗前沿,2007,2(12):37-38.[15]许海林,吴小勇,聂少平,等.黑木耳多糖提取工艺优化及其对小鼠巨噬细胞功能的影响[J].食品科学,2016,37(10):100-104.[16]刘荣,栾淑莹,程萍,等.酸性黑木耳多糖降血脂功能的实验研究[J].营养学报,2016,38(4):408-410.[17]SalatielWDS,ArenhartHeberleAN,PereiraSantosA,etal.AntibioticsmineralizationbyelectrochemicalandUV-basedhybridprocesses:evaluationofthesynergisticeffect[J].EnvironmentalTechnology,2018:1-23.[18]秦令祥,周婧琦,崔胜文,罗双雄,高愿君.动态超高压微射流法提取黑木耳多糖工艺研究[J].食品研究与开发,2019,263(5):462-300.[19]刘大纹,李铁柱,孙永海.黑木耳多糖提取工艺的优化[J].农业机械学报,2007,38(5):