DNA合成误差校正

ErrorcorrectioningenesynthesistechnologyTrendsinBiotechnologyMarch2012,Vol.30,No.3

基因的合成通常是用酶组装通过化学方法合成的寡聚合甘酸，合成的结果不可避免的出现缺失、插入和碱基替换等情况，基因合成的保真度是确保基因正确表达的首要条件，在自然条件下，不管原核还是真核生物其合成基因的错误率一般在1/107左右，而我们人为的基因合成其错误率一般在1/102左右.本文介绍了一些基因合成过程中校正技术。1)合成寡核苷酸过程中的错误删除。2)合成基因过程中的错误删除。2.1)用MutS错误不协调绑定蛋白消除错误。2.2)用不协调切断酶校正错误。目录亚磷酰胺法示意图合成流程1）1）主要错误的形式：第一、亚磷酰胺单体没能结合到延伸链上，导致出现缺失出现，出错率在1.5%~0.5%左右。第二、尚未耦合的链被乙酰化而终止反应，导致提前终止合成，出错率在0.5%左右。第三、第二步合成过量的催化剂会导致DMT脱保护，然后再结合一份子亚磷酰胺而导致插入的出现，出错率在0.4%左右.1）错误的排除方法用HPLC和PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）通过长度大小的不同对其进行纯化。疏水的净化筒可以对尚未脱去DMT保护基的Oligos进行纯化，用这两种方法可以除掉90%的杂质（大部分是插入、删除和切断）。缺点是：人力劳动量太大，而且没办法除去碱基替换和单个碱基的插入或删除。2)

尽管对Oligos经过了繁琐的纯化还是有一部分错误会随着Oligos进入下游的合成中，而且在聚合酶的延伸过程中也会引入一些新的错误，例如错配等。选择一个正确无误的基因序列经常要用到克隆测序的方法，此外表达分析和functionalscreens也经常用于检查基因的正确与否，但是这种方法只对蛋白的编码区域有效，对其他不表的区域无效。2)对于长链DNA的合成一般是通过合成长度小于1kb的BB，测序正确之后再把BB连成长的基因.下面介绍一大类在基因合成过程中排除错误的方法：用MutS错误不协调绑定蛋白消除错误；

用不协调切断酶校正错误。作用机理如图所示2)2.1）

MutS蛋白是一种细菌的MutHLS错配修复器的一部分，它能够识别并绑定各种错配碱基。在变性和再次退火之后，错误包含在异源双链核酸分子中，用MutS蛋白把含有错误的链给绑定，通过凝胶电泳来分离。这种方法经一次处理能使错误减小到1/3.5kb，其缺陷是需要其自身大量双联是正确无误的。对于错误多的可以采用以下方法，这种方法叫consensusshuffling,DNA经过退火后，加入限制性内切酶的混合物，然后加入到固载有MutS蛋白的筒形过滤器中，洗脱再做一个菌落PCR即可消除错误。MutS错误不协调绑定蛋白消除错误核酸内切酶2.1）2.2）用不协调切断酶校正错误

不协调切断酶是说一类能够在异源双链核酸分子中识别和切断错配序列的限制性内切酶，它可以分为三类：第一类是游离酶，例如：噬菌体T4内切酶VII，T7内切酶I，大肠杆菌核酸内切酶V；第二类是错配修复核酸内切酶MutH；第三类是单链特异性核酸酶，例如：S1核酸酶，P1核酸酶，绿豆核酸酶，CEL核酸酶。

游离酶的作用机制：

Thereannealedheteroduplexesarecleavedinbothstrandsbymismatch-specificenzymes2–5bpdownstreamofthemismatches,generatingstaggerendsthatareimmediatelydissociatedatthereactiontemperature.Thesingle-strandedoverhangsthatcontainmismatchbasesaredegradedbyanexonucleaseinthereactionmixture.Full-lengthgeneswithfewererrorsarerecoveredbyoverlapassemblyPCR错配修复核酸内切酶MutH大肠杆菌的MutH,MutL和MutS蛋白构成的细菌错配修复机制：首先是MutS检出并绑定错配碱基和single-strandloops，然后MutH和MutL一起作用于MutS绑定的突变体，在两股链不匹配的地方产生切口，再通过解旋酶和外切酶的作用是错配位点形成平末端。形成的缺口可以用聚合酶和连接酶补齐。单链特异性核酸酶单链特异性的核酸酶在一定程度上非常专一性的作用特定的错误为类型，例如：SI和P1核酸酶能够更有效作用于富含AT的区域，S1不能够识别单个不匹配的碱基，而绿豆核酸酶在pH6–6.5的条件下能够切除一定量单个碱基的突变。CEL核酸内切酶是第一个从真核生物中发现的核酸内切酶，它能够作用于各种类型的碱基的错配和DNA的畸变。

CEL核酸内切酶作用机制：错配的碱基先通过CEL核酸内切酶切开和再用PhusionDNApolymerase校正，这种方法非常适合于错误较多的合成序列。低质量的合成序列经过退火一般都会产生少量的无误的双链DNA，CEL核酸内切酶在异源双链核酸分子中紧挨着错误位点切开，PhusionDNApolymerase切掉错误的位点，最后无误的DNA片段通过PCR组装成全长的基因。steps:(i)reannealingofassembledgeneconstructstopresenterroneousbasesasmismatches;(ii)CELnucleasecleavageonbothstrandsatthe3`sideofthemismatches;(iii)exonucleasetrimmingofsingle-strandedmismatchoverhangsbyaddedexonucleaseorthe3-5exonucleaseactivityoftheproofreadingPCRenzyme;and(iv)reasse