生化工艺第三章培养基的选择与灭菌1

生物化工工艺学

第三章培养基的选择与灭菌任课教师：陈磊祥谷氨酸和味精生产工艺的培养基淀粉水解后的糖化液玉米浆糖蜜无机盐其它培养基的定义提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一、概述

葡萄糖或乳糖总量的10%玉米浆4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%猪油或植物油（消泡剂）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水生产青霉素工艺培养基从上面例子可看出，发酵培养基组成成分包括碳源如葡萄糖、淀粉；氮源如硫酸铵、玉米浆；无机盐和微量元素；前体和诱导物等。一个良好的培养基配方组成是经过较长时间的研究并经过一定时间的生产实践之后确认的，但并不是一成不变的，它也要随着生产菌种的不断改良、发酵工艺条件的不断改进以及发酵罐结构的不同而不断地改进、调整、趋于完善，以达到充分发挥菌种最大的生产潜力。

补充1：微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物

1、微生物细胞的化学组成微生物成分细菌（%）酵母菌（%）霉菌（%）水分75-8570-8085-90蛋白质50-80（干重）72-7514-15碳水化合物12-2827-637-40脂肪5-202-154-40核酸10-206-81无机元素2-303.8-76-12由表可知，微物细胞含有80%左右的水分和20%左右的干物质，它主要是由C、H、O和N等元素组成，约占全部干物质的90%至97%，此外还含有各种无机矿物质，依次为：PKMgCaSNa及微量元素。

营养物质的确定，主要依据细胞的化学组成及所代谢物的化学组成。因此，分析微生物细胞的化学组成是了解微生物营养的基础。2、微生物胞外代谢产物

微生物在生长过程中，除利用外源营养物质合成新的细胞外，还会产生一些有机化合物分泌到微生物的体外，这些胞外代谢产物的种类繁多，且因微生物的种类而异。因此，了解这些代谢产物的化学组成，极有助于微生物培养时的营养物质的选择和代谢产物的积累。一般来说，微生物的胞外代谢产物的主要包括下面四个部分。1）代谢副产物

这类产物主要是指伴随微生物细胞正常代谢作用所产生的一些小分子化合物。如：CO2、H2、CH4等气体和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子量的醇类、脂肪酸类和酮类，其中许多物质是重要的化工原料。

产物名称用途主要生产菌甲烷能源奥式甲烷杆菌乙醇、异丙醇医药、化工原料、饮料等酵母菌异丙醇、丙酮、丁醇防冻剂、火胶溶剂、树胶等丁酸梭菌丙酮、丁醇、甘油重要的有机溶剂丙酮丁醇梭菌甘油、甘露醇溶剂、润滑剂、化妆品、硝化甘油炸药醇母菌甘露醇、乙酸合成树脂、增韧剂等曲霉菌乙酸食醋、化工原料产醋酸杆菌草酸印染、漂洗皮革、制造塑料和染料曲霉菌和青霉菌乳酸食品乳酸医药和化工原料乳酸菌2）中间代谢产物

指细胞在代谢途径中产生的用于合成蛋白质、核酸、类脂和多糖等细胞物质的一些小分子物质。如氨基酸、核苷酸、有机酸和单糖的衍生物。中间代谢产物一般不分泌到微生物体外，而只有当微生物细胞生物合成受阻或外源碳源浓度较高的情况下，才会有大量的积累和外流。不少中间代谢产物也是重要的食品和化工原料。

产物名称用途主要产生菌延胡索酸抗氧剂、合成树脂、染料黑根霉琥珀酸制漆、染料根霉菌苹果酸食品黑曲霉柠檬酸饮料、化工原料黑曲霉核黄素医药棉病囊霉谷氨酸味精谷氨酸棒杆菌肌苷酸调味品产氨短杆菌3）次级代谢产物

这类代谢产物是指由微生物细胞合成的，分子比较复杂的一些化合物，它既不参与细胞的组成，又不是酶的活性基团，也不是细胞的储存物质，它们中的大多数分泌于微生物的体外。

如抗生素、毒素、激素和色素等几类

4）

胞外水解酶类

许多微生物可产生胞外水解酶类。这类水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等。可用于食品、酿造、纺织、制革、医药和生化试剂等各个领域。初级代谢产物和次级代谢产物包括哪些物质？问题补充2：微生物的营养物质和营养类型

微生物四大营养类型

光能自养型光能异养型化能自养型化能异养型微生物六大营养要素碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水专性好气微生物。这类微生物只能在有空气或有氧的条件下才能生长，包括了全部的霉菌、大部分的放线菌及部分的细菌。专性厌气微生物。这类微生物只能在没有空气或无氧的条件下才能生长，包括了部分细菌、放线菌。兼性微生物。这类微生物既生物既在空气或有氧的条件下生长，又能在没有空气或无氧的条件下生长，包括了酵母菌及部分细菌。问题3根据微生物对氧的要求，微生物可分为哪几类？二、培养基的成分重点内容生产青霉素工艺培养基从微生物的营养要求来看，所有的微生物都需要水、能源、碳源、无机元素及生长辅助物质，如果是好氧微生物则还需要氧气。在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基是相当简单的，虽然它能满足微生物的生长要求，但在大规模生产上往往是不适合的。

葡萄糖或乳糖总量的10%玉米浆4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%猪油或植物油（消泡剂）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，尽可能地满足下列条件：每克消耗的底物将产生最大的菌体得率或产物得率；能产生最高的产品或菌体的浓度；能得到产物形成的最大速率；副产品的得率最小；价廉并具有稳定的质量；来源丰富且供应充足；在通气和搅拌、提取、纯化、废物处理及生产工艺过程都比较容易。1、工业上经常使用的碳源

在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物（各种糖类）、脂肪、有机酸和醇、碳氢化合物等作为碳源。使用最广的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用来自其他谷物、马铃薯、木薯的淀粉。淀粉可用稀酸和酶快速水解产生不同的葡萄糖制备物。表3-2微生物发酵生产中使用的糖类

霉菌和放线菌还可以用油脂作碳源。一般地说，在培养基中糖类缺乏或发酵至某一阶段，菌体可以利用油脂。常见的油脂主要指动、植物油，如豆油、玉米油、棉子油和猪油等。在发酵过程中加入的油脂起消沫和补充碳源的双重作用。菌体利用油脂作碳源时耗氧量增加，因此必须充分地供氧，否则易导致有机酸积累，发酵液的pH值降低。油脂在贮藏过程中易酸败，同时还可能增加过氧化物的含量，对微生物的代谢有毒副作用。使用时注意将油脂贮藏在低温条件下，贮藏时间不宜过长。问：发酵过程中加入的油脂起有何作用？使用时应注意什么？填表：生产菌最优先C源嗜甲烷棒状杆菌乳糖发酵短杆菌3790青霉素发酵抗生素和甾类转化的发酵维生素C发酵2、工业上经常使用的氮源

工业生产上所用的微生物都能利用无机或有机氮源，无机氮源包括了氮气、铵盐或硝酸盐等。有机氮源包括了玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、酒精干燥可溶物、酪蛋白水解液、屠场废物、鱼粉、酵母浸出液等。一般来讲，有机氮源更有利于微生物生长。玉米浆是玉米提取玉米淀粉后留下的副产品。1、无机N源包括哪些？有何特点？问题2、为什么说微生物吸收利用铵盐比硝酸盐的能力强？3、无机N源是如何改变培养液的pH的？(NH4)2SO4→2NH3＋H2SO4NaNO3＋4H2→NH3＋H2O＋NaOH4、什么叫生理酸性物质和生理碱性物质？举例说明。1、有机N源包括哪些？有何特点？问题1）成分比较复杂

2）被菌体利用的速度不同3）微生物对氨基酸的利用有选择性

4）是引起发酵水平波动的主要因素

3、无机盐和微量元素

工业生产上，常使用合成培养基，因此需要添加诸如镁、磷、钾、硫、钙、钴、铜等微量元素。

常用无机盐：KH2PO4MgSO4·7H2OKClCaCO3CuSO4·5H2O等。分别有不同作用。问题许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度相关，低浓度时往往呈现刺激作用，高浓度却表现出抑制作用，举例说明。如青霉素发酵中，发酵培养基中的铁离子（Fe2+）浓度为6μg/ml时，不影响青霉素的生物合成，当Fe2+浓度达60μg/ml时，青霉素产量下降30%，当Fe2+浓度达300μg/ml时，产量下降90%。锌、镁、钴等是某些酶的辅酶或激活剂。微量的锌对青霉素发酵有促进作用，过量时呈现抑制作用。4、水水是菌体生长所必不可少的，它构成培养基的主要组成成分。水在细胞中的生理功能主要有：①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，进而有效地控制细胞内温度的变化；⑤保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素；⑥微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。5、前体物质和促进剂工业发酵过程中通常要添加一些有助于产物的形成，而对菌体生长影响不大的前体物质、抑制剂或诱导剂等代谢调节物质。注意：这些物质加入到培养基中有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长。阅读P34-37，回答问题1）抗生素发酵常用前体物质有哪些？4）名词：前体物质、促进剂？2）在青霉素的生产过程中，为什么加入玉米浆后，青霉素的单位有很大提高？3）前体物质是否加越多越好？5）在培养基中添加哪些微量的促进剂可大大地增加某些微生物酶的产量？有些工业酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等。诱导物的存在能大大促进诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物，如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。在酶的发酵生产中，培养基中必须加入诱导物。一些工业上重要的酶诱导物微生物产物酶诱导物曲霉菌产气气杆菌灰色链霉菌大肠杆菌枯草杆菌链球菌链霉菌曲霉菌毛霉菌绿色木霉曲霉菌α-淀粉酶普鲁蓝酶α-甘露糖酶青霉素酰基酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶纤维素酶果胶酶淀粉、麦芽糖麦芽糖酶母甘露糖苯乙酸许多蛋白质许多蛋白质许多蛋白质许多蛋白质许多蛋白质纤维素果胶6）常用的促进剂有哪些？7）名词：抑制剂？举例说明发酵过程中使用的一些抑制剂微生物产物抑制剂主要作用啤酒酵母金霉素链霉菌谷氨酸小球菌黑曲霉中海诺卡氏菌甘油四环素谷氨酸柠檬酸利福霉素B亚硫酸钠溴青霉素碱金属、磷酸二乙巴妥盐阻止乙醛的生成阻止氯四环素的产生增加细胞壁透性草酸被抑制其他利福霉素被抑制6、消沫剂1）在发酵中，为什么要加消泡剂，常用哪些物质？7、其他成分微生物生长繁殖需要的生长因子如维生素等，在所使用的碳源和有机氮源中含有的数量已能满足绝大多数微生物代谢的需求，但某些微生物的培养基尚需加入某些微量生长因子，以满足其代谢的需要。以青霉素培养基为例，说说各成分的作用？复习：生产青霉素工艺培养基葡萄糖或乳糖总量的10%玉米浆4%-5%苯乙酸0.5%-0.8%猪油或植物油（消泡剂）0.5%PH值、K、Fe、Mn、Zn、Cu等，其余水第二节、培养基的种类与选择根据培养基的特殊用途不同，可将培养基分成：

分离纯化、原生质体再生、增殖、选择和鉴别培养基

根据培养基状态不同，可将培养基分成：

固体、液体和半固体培养基

根据营养物质的来源不同，培养基可分为：

天然培养基、合成培养基和半合成培养基

问题2固体培养基与半固体培养基是如何界定的？问题1发酵生产中的培养基属于哪一类培养基？1、培养基的分类生化生产中常用培养基发酵培养基

种子培养基孢子培养基问题2起到什么作用？培养基配制时有哪些要求？举例问题1起到什么作用？培养基配制时有哪些要求？举例问题3起到什么作用？培养基配制时有哪些要求？第四讲开始注）培养基的配制原则根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基营养成分的恰当配比（C/N）渗透压

PH值氧化还原电位2、培养基的设计3、培养基的筛选理论计算法统计法（单因子试验法、正交试验设计和均匀试验设计）连续培养法什么叫细胞产率系数？名词消耗1克碳源底物产生的干微生物细胞克数。1、理论计算法碳源和能源＋氮源＋其它所需物质细胞＋产物＋CO2＋H2O＋热量2、统计法因子水平

A葡萄糖

%

B豆饼水解液%

C玉米浆%

D硫酸氨

%

1

2

31012.515234123543赖氨酸发酵试验水平和因素表3、连续培养法培养时间光密度（菌体浓度）