感染性疾病的分子生物学检验技术-遗传学疾病的分子生物学检验技术-医学院课件

感染性疾病分子生物学检验技术遗传性疾病的分子生物学检验技术

感染性疾病是由特定病原体感染机体后所产生的一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生虫等。

可采用微生物学、生物化学、免疫学和血液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴定等方面还存在着较大的缺陷。

随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势，并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。第十章

病毒病的分子生物学检验一、病毒感染的一般性检出策略一般性检出策略，只能提供是否存在某种病毒感染，通过常用核酸杂交或PCR技术直接检出病原体的核酸，是快速诊断机体有无病毒感染的首选方法。可以根据病毒本身的保守序列设计PCR引物或制备特异性探针。第一节病毒病分子生物学检验策略二、病毒感染的完整性检出策略

完整性检出策略，不仅对病原体的存在与否做出明确判断，同时能够诊断出病毒携带者和潜在感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、基因分型（包括亚型）检测和耐药性鉴定。常采用核酸杂交、PCR、基因芯片和DNA测序等技术。第二节

乙型肝炎病毒的分子生物学检验乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携带者，我国约50％-70％的人群感染过乙肝病毒，其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝癌发病率也在增加。HBV感染后可以引起急性、慢性病毒肝炎，而且与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的关系。HBVDNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是已知可感染人类最小的DNA病毒。基因组长为3.2k,HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：携带有病毒全部的编码信息，模板编码病毒蛋白；短链为正链S(+)：在不同的分子中长度不等，约负链的50%～100%。乙型肝炎病毒基因组结构一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征HBVDNA为了能在细胞内独立复制，其编码区有广泛的重叠，以扩允其编码容量。多个ORF可读码2次以上，编码2个以上蛋白质。HBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个可读框（ORF)，其中S、C、P、X4个ORF是早已公认的。2、C基因区1、S基因区S基因区分为：前S1区、前S2区和S区。编码外膜蛋白，前S区与病毒的嗜肝性有关。其中S基因编码外膜主蛋白（即S蛋白）是乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的主要成分。C基因区分为前C区和C区两部分。C区由459个核苷酸组成，编码产物为183个氨基酸残基组成的多肽序列，称为乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）；由前C基因和C区编码212氨基酸残基组成的多肽称为乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。3、P基因区4、X基因区是HBVDNA中最大的一个ORF，与其他基因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒DNA的多聚酶蛋白(HBVDNAP）。通过研究P基因的结构与功能，可进一步探索抗HBV治疗的新方法。是HBVDNA中最小的一个ORF，编码产物为x蛋白(HBxAg)。可能是一种反式激活因子，与病毒基因组的表达调控及HBVDNA的整合有关。x蛋白所诱生的抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜负链DNA包裹后的前基因

mRNA传染性HBV病毒颗粒传染性HBV病毒颗粒部分双链DNA逆转录酶DNA聚合酶肝细胞二、乙型肝炎病毒的分子生物学检测方法（一）乙型肝炎病毒DNA的检验HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志。定量检测HBVDNA对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药物疗效等有重要意义。cccDNA半衰期长，在体内难以清除，因此检测cccDNA对于了解病毒的复制和感染有同样的价值。1、PCR法

传统PCR方法检测HBVDNA的灵敏度可以达到ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的复制程度，为临床提供从分子水平上对病原体进行诊断提供依据。2、核酸分子杂交

将待测标本点状加样于硝酸纤维素薄膜上，与标记的HBVDNA寡核苷酸探针进行斑点杂交，从而检测待测标本中是否存在HBVDNA。HBV-DNA常用的分子生物学检验方法以下不能对探针进行标记的物质是？A：

生物素B：

多糖C：

磷32D：地高辛3、荧光定量PCR法荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBVDNA检测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地反映HBVDNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。4、支链DNA技术(bDNA技术)

bDNA技术的最大特点是对目标核酸直接进行检测，放大倍数确定，稳定性及重复性高。用bDNA信号放大系统检测标本中的核酸时，靶核酸本身不被扩增，而是通过多个探针组成逐级信号放大，以检测核酸。合成3个探针和bDNA分子，3个探针分别称为捕获探针、靶探针1和靶探针2。将捕获探针固相化在微孔板上，靶探针1可分别与待测核酸及固相化的探针杂交，而靶探针2可分别与待测核酸及bDNA杂交。这样，在杂交反应完成后，就形成了固相~捕获探针~靶探针1~待测序列~靶探针2~bDNA复合物，借助酶的催化反应就能定量检测待测核酸的含量。其基本原理为：该系统采用特异的RNA探针与靶分子HBVDNA

杂交形成RNA-DNA杂交分子。多个RNA-DNA杂交分子用通用抗体捕获于微孔中，然后采用偶联有碱性磷酸酶的多克隆抗体检测杂交分子（该过程产生信号放大）。偶联的碱性磷酸酶采用发光底物来检测。其信号可以被放大3000倍，检测限为4.7×103copies/ml。5、杂交捕获系统根据HBV高度保守的特异性基因序列设计寡核苷酸探针制备基因芯片，将待测病人的样本进行PCR扩增，杂交结果经扫描仪读数并输出图像，然后通过计算机分析，从而检测病人是否有病毒感染、感染病毒的种类。6、基因芯片技术

（二）乙型肝炎病毒的基因分型HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亚洲人群E型主要存在于西非F型仅见于中南美洲的土著人G型和H型很少见不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型1、序列特异引物PCR法（PCR-SSP）2、PCR-RFLP法3、线性探针反向杂交法（LiPA）4、基因序列分型方法（SBT）5、基因芯片法6、PCR微板核酸杂交酶联免疫反应法（PCRmnh- ELISA）目前对HBV进行基因分型的方法主要有：

1、PCR-SSP12345678PCR12345678引物特异性2、PCR-RFLP法3、线性探针反向杂交法（LiPA）常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定、阿德福韦等。拉米夫定抗病毒治疗的靶点在HBVDNAP的逆转录酶区。用药机制：核苷（酸）类似物与HBVDNAP的自然底物（dNTP）竞争性结合酶的结合位点，导致HBVDNA合成终止，达到抑制HBV复制的目的。因此与DNAP结合力的强弱决定了该类药物的疗效。抗药机制：当HBVDNAP氨基酸序列改变并影响到其空间结构变化时，使HBVDNAP与核苷（酸）类似物结合能力明显下降，于是产生耐药性。（三）乙型肝炎病毒的耐药性分析HBVYMDD变异耐药机制第552位的甲硫氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）替代后，使此侧链缩短，结合位点变大，不在适合拉米夫啶结合而耐药。Met--------ATGValIle----------------GTGATTYMDDYVDDYIDD1、SBT法是最直接最有效的检测点突变的方法，可以对单一位点或者对多位点变异进行检测，结果可靠。2、PCR-RFLP法

分别设计探针对YMDD野生型和突变型特异性引物进行PCR扩增产物用相应的限制性内切酶进行酶切电泳，通过酶切图谱鉴别HBV野生株和变异株。3、线性探针反向杂交法（LiPA）是一种用于拉米夫定和阿德福韦诱导HBVDNAP基因突变的检测方法，利用逆转录酶基因型杂交探针检测野生株、突变株逆转录酶编码区内多态性密码子。4、荧光定量PCR方法（Real-timeRCR）确定探针特定的Tm值来区分是否突变

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃A.加热变性时DNA溶液A260达到最大值一半时的温度称为熔解温度(Tm)B.加热变性时DNA溶液A260达到最大值时的温度称为熔解温度(Tm)C.A+T比例越高，Tm值越高D.以上都不对Tm值？三、分子生物学检验的临床意义1、病毒载量检测HBVDNA的检测是判断HBV复制水平和传染性强弱的直接标志。对病毒载量进行测定，可用于确定感染者感染程度，DNA拷贝数越高，病毒复制越活跃，传染性超强，肝脏损害和肝脏组织炎症反应可能越重。HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对药物的敏感性有关。2、病毒分型检测HBV耐药性的检测在临床上主要是对HBVDNA多聚聚P基因的检测，即鉴别是野生型(YMDD)还是存在耐药突变型(YVDD或YIDD)检测结果可为抗病毒药物治疗中HBV耐药性产生提供依据。拉米夫定耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDD→YVDD/YIDD，并且M552V是拉米夫定耐药突变的主要形式，可导致病毒复制反弹，HBVDNA及ALT水平升高。目前,YMDD的检测技术虽多,但尚无”金标准”。3、耐药突变检测基因组结构分子生物学检测基因分型检测耐药性检测HBV部分单链区环状双链DNAPCR、核酸杂交，杂交捕获法，基因芯片、荧光定量PCR等PCR-SSP、PCR-RFLP、反向杂交基因芯片SBT、PCR-RFLP、线性探针反向杂交HCV单链正链RNART-PCR、SBT、PCR-RFLP、PCR-SSOHPV双链闭环DNA核酸杂交、PCR（多重PCR、realtime-PCR）核酸杂交、PCR（多重PCR、realtime-PCR）HIV双链RNA（正义RNA）RT-PCRSBT、PCR-RFLP、基因芯片、多重PCR、DEIA流感病毒单链RNA（负链RNA）RT-PCR、多重PCR、PCR-RFLPPCR、SBT病毒病的分子生物学检验第十一章

细菌感染的分子生物学检验细菌感染性疾病分子生物学检验的意义1、不易培养的病原菌（营养苛求菌）难以培养的病原菌（生长缓慢）2、鉴定病原菌（特异的分子标志物）3、检测病原菌的耐药基因，鉴别耐药株4、基因分型，流行株分型一、细菌感染的一般性检出策略细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有无细菌感染和是何种病原体感染。第一节细菌感染的分子生物学检验策略二、细菌感染的完整性检出策略完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断，还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原体的相关信息。第二节细菌感染的广谱分子生物学检测一、16SrRNA基因序列分析鉴定细菌16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA(核糖体RNA)是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有染色体基因中。1、细菌16srRNA基因结构特征多拷贝多信息长度适中设计通用引物 PCR扩增扩增产物序列分析，测序及可变区进行分子杂交，可鉴定病原菌种类新生儿败血症新生儿化脓性脑膜炎慢性前列腺炎2、16srRNA基因序列分析鉴定细菌原理3、细菌16S-23SrRNA基因序列分析鉴定细菌16S-23SrRNA基因位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之间的区间序列，具有高度变异及相对保守性，对于菌种间的鉴别，还可以分辨16srRNA不能鉴别的非常接近的菌种具有重要意义。二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定细菌（MALDI-TOF-MS）1、原理：细菌体内蛋白质含量高，种类及结构稳定，且大多数蛋白质的分子量处于MALDI-TOF-MS分析的范围。因此细菌鉴定过程中，蛋白质也是重要的分子标志物。细菌核糖体蛋白是细菌鉴定重要的分子标志物2、

MALDI-TOF-MS蛋白质量指纹图谱（PMF）将受检微生物PMF与数据库中已知微生物PMF进行比较，即可得到鉴定结果第三节

结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫情死灰复燃。TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚集成团，用抗酸性染色被染成红色。对陪养要培求特殊条件，一般要经4-6周才出现肉眼可见的菌落。TB通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜侵入机体，它被吞噬后能在吞噬细胞内繁殖，导致巨噬细胞裂解，还可在细胞外繁殖。TB天然地对很多抗生素有抵抗力，使得治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多药物外排泵系统。目前结核杆菌常规检测方法痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。TBH37Rv全基因组为环状双链DNA，长约4.4Mb，G+C平均值65.6%，其基因序列高度保守。一、结核分枝杆菌的基因组结构特征TBH37Rv基因组中共有3924个开放阅读框，其中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始密码子61%为ATG，35%为GTG。所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。TB不同菌株之间存在多个差异基因。（一）TB特异基因检测方法可采用PCR、Real-timePCR、PCR-RFLP、线性探针杂交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验（AMTDT）、基因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的TBDNA。二、结核分枝杆菌的分子生物学检测方法常规PCRPCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TBIS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污染、假阳性、假阴性、实验室污染。Real-timePCR与传统PCR相比，有敏感度、特异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓慢的结核杆菌的检测更有优势。1、PCR基本原理：靶DNA序列加热变性后引物与其互补DNA单链退火，在DNA引物与靶DNA序列上对应的DNA单链杂交，在聚合酶作用下产生带酶切识别位点的目的DNA序列，该双链DNA进入SDA循环。SDA法以IS6110和16SrRNA基因为扩增靶点，该方法特异性好。2、链替代扩增技术（SDA）SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术3、线性探针杂交

其原理是应用生物素标记的特异引物进行靶核酸的扩增，将产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果，一次杂交可以检测多种靶序列。简便、快速、敏感。4、焦磷酸测序广泛用于鉴定分型；是检测基因突变的金标准。5、基因芯片以结核杆菌16SrRNA基因和耐药基因为检测对象。高通量，可实现对TB的分类鉴定及耐药基因的快速检测，成本较高。6、Xpert全自动结核杆菌检测技术该方法以半巢式荧光定量PCR技术为基础，能够直接从病人痰液中同时检测TB以及利福平耐药基因rpoB，检测过程自动化。被认为是目前最先进的一种检测TB及其耐药性的方法。647、RT-PCR检测TB活菌前述分子生物学检测方法均是基于对TBDNA的扩增，对TB活菌或死菌的检测结果都会是阳性，无法鉴定死菌和活菌。由于细菌mRNA半衰期很短，因此TBmRNA被认为是活菌检测的理想分子标志物。对样本处理要求较高。65（二）结核分枝杆菌的耐药基因检测1、TB耐药检测意义近年来，由于TB耐药菌株的不断出现和传播造成耐药结核病的流行，特别是耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB)的增加，给结核病的防治带来严峻挑战。672、TB的耐机制TB产生耐药性的分子机制主要是其染色体特定基因变异所导致。利福平、异烟肼、链霉素等防治结核病的一线药物，在结核病临床治疗中均可以产生耐药。TB耐药相关基因主要是一些编码代谢酶、16SrRNA等基因，这些基因的突变造成结核分枝杆菌产生耐药性。耐利福平分子机制：是由于其作用靶标-结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。当rpoB中507-533位密码子的核心区域—耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，使DNA依赖RNA聚合酶β亚单位酶结构改变利福平不能与细菌的RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG和编码526