生化分离工程实验2014修改版

生化分离工程实验指导老师：郝勃电子邮箱：haobo@联系电话：办公地点：菌株的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)检索感兴趣的基因（以katB为例）直接优化并合成连T载测序结构解析重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernblotting结晶本次试验内容本次试验的主要内容His-Tag系统pMAL系统katBfabZkatB是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的过氧化氢酶，其催化细胞内过氧化氢分解，保护细胞组织，防止膜脂过氧化。在菌体中常以四聚体的形式存在。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱氢酶，是大肠杆菌脂肪酸代谢途径中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。背景资料——目的基因fabZ

基因：474bp；蛋白17.8kDa，酶切后MBP标签

42.5kDa

katB基因：1467bp；蛋白55.8kDa背景资料——表达载体pMAL-c2系列的载体带有malE信号序列，能使融合蛋白穿过细胞膜。Imidazole（咪唑）

竞争关系背景资料——组氨酸和Ni-NTA亲和作用原理系统原理示意图pMALMBP标签

42.5kDaSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂。它能打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白，掩盖电荷差异和形状区别，使得电泳速率只与分子量有关。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。引发剂是过硫酸铵(APS)，催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）。背景资料——聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳，根据电荷差异和分子大小不同来分离蛋白质。浓缩效应和分子筛效应注意事项：有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用。因此必须小心操作，不得吸入和接触皮肤，聚合完全聚丙烯酰胺凝胶无毒。凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.电泳前确保玻璃杯下面的气泡去除干净！生化分离工程实验安排一、接种按2%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号、基因信息、抗性）。二、诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，基因名）记作“诱导前”，放于离心管板中，于-20℃保存。配试剂将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200µl于1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清(可用枪将上清吸尽)。加入200µl的无菌水洗涤菌体上残留的培养基，10000rpm离心1min，弃上清，然后重悬于40µl灭过菌的去离子水中，100℃煮沸15min。

10000rpm离心1min，取上清5µl作为菌落PCR的模板。三、菌液PCR（验证目的基因已转入宿主菌中）PCR体系H2O8µl10XPCRbuffer2.5µldNTP2.0µl上游引物(F)1µl下游引物(R)

1µlTaq酶0.5µl模板5µl总体积20µlPCR程序95℃5min95℃35s55℃30s72℃40s/90s72℃10min25℃5minCycle30注：阳性对照(将模板换成1µl质粒)；阴性对照（将模板换成5µl

H2O）；不用重复，PCR管上做好标记！琼脂糖凝胶电泳1.制备0.8%琼脂糖凝胶(已配好)。

2.胶板制备:将干净的胶板放入胶槽中，并在固定位置放好梳子。再将配好的琼脂糖凝胶在微波炉里充分融化，冷却

到65℃左右后小心地倒入胶槽内。室温静置直至凝

胶完全凝固，垂直轻拔梳子。将胶板放入电泳槽中，

添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。3.加样:将PCR后的样品和与LoadingBuffer充分混匀后加入胶孔

中。每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染。4.电泳:打开电源进行电泳（电压80V）。约30min后，停止电泳。5.电泳完毕后，取出凝胶用溴化乙锭（EB）染色。6.观察照相:在紫外灯下观察并用拍照保存。将加入诱导剂后的菌液再放入37℃，200rpm的摇床中诱导培养4-5h后收集菌体。注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，基因名）记作“诱导后”放在第八组的离心管板上。离心时用天平严格配平（差异在0.02g之内)！四、收菌五、裂解细胞将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（

200-300w超声6×10s-10s，约20min）,天平严格配平后10000*g，4℃，离心20min。上清取1ml于1.5ml离心管中，作标记为“上清”沉淀用1ml对应的buffer（his-tag为bindingbuffer，pMAL为columnbuffer）重悬后，保存在1.5ml的离心管中，标记为“沉淀”。六、蛋白纯化注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL™系统MBP标签的切除从A595最大的几管(一般是第二、第三管)取80µl用于蛋白酶FactorXa的酶解。在80µl洗脱液中取15µl保存在pcr管中，作为酶切对照。剩下的65µl加入3µl的FactorXa后混匀，室温下反应2h。分别在0.5h、1h、2h取样15µl。注：每次取样做好标记后，将样品放于-20℃保存Ni柱的清洗与保存第1步：2倍体积6M盐酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍体积水第3步：1倍体积2%SDS（注意低温容易析出）第4步：1倍体积25%乙醇第5步：1倍体积50%乙醇第6步：1倍体积75%乙醇第7步：5倍体积100%乙醇第8步：1倍体积75%乙醇第9步：1倍体积50%乙醇第10步：1倍体积25%乙醇第11步：1倍体积水第12步：5倍体积100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍体积水由于EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换His·Bind树脂。树脂的再生当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。七、配制SDS注意：梳子厚度与胶板厚度要配套！

八、SDS电泳点样顺序：诱前、诱后、上清、沉淀、穿透液、W1、W终、Marker、E1、E2、E3、酶切后点样：按1:1比例，取样品加入loadingbuffer中，置沸水浴中煮沸10min，冷却，离心1min，取上清液20ul点样。(记录点样顺序)点样完毕后即可开始电泳，先以80v电压跑15-20min，蛋白质通过积层胶后，更换到120v，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3h左右。染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。1、标准曲线的制作（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成各浓度的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1L。九、蛋白浓度测定每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，2~5min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲。注：震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除.管号1234567katB和Fabz(ul）