微生物学 04 微生物的营养

第四章微生物的营养第一节微生物的营养要求第二节培养基第三节菌种分离及保藏技术第一节微生物的营养要求一、碳源除水分外，需求最大(占干细胞重50%)。

1.包括：有机碳和无机碳。

2.功能：提供C和能量。

3.优先利用：如葡萄糖效应（葡萄糖、乳糖）。二、氮源1.功能：提供N和部分能量。2.种类：无机和有机氮。3.优先利用：（NH4）2SO4被认为速效氮源。如龟列链霉菌（产土霉素），利用玉米浆＞黄豆饼粉和花生饼粉。利用混合氮源，控制菌体生长和产代谢物→提高土霉素产量。三、无机盐大量元素(10-4-10-3moL/L)：P、S、K、Mg、Fe、Na等；微量元素(10-8-10-6moL/L）：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等，须控制量。功能：酶的激活剂（Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+），维持大分子和细胞结构(Ca,Mg,Fe等)，调节渗透压（Na+）和无氧呼吸氢受体(NO3-,SO42-)等。四、生长因子（酶的辅酶或辅基）1.种类维生素（传统生长因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。2.微生物对生长因子的利用（1）能合成全部：占大多数（自养型），过量合成型（链霉菌→VB12）。（2）不能或只能部分合成（异养型）须额外添加对应因子；如乳酸菌：添加嘌呤→核苷酸；支原体：添加甾醇。注：菌不同→需生长因子的种类和数量不同;同种菌，环境不同→需生长因子不同。如鲁氏毛霉：在厌氧→需VB1+生物素；好氧→自身合成。五、水1.分为自由水和结合水。2.水活度(aw)微生物可实际利用的环境中自由水的量，或生长环境中水的有效性。一定温度和压力下，溶液蒸汽压与同条件下纯水蒸汽压的比值。几类微生物生长最适w微生物w一般细菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80嗜盐细菌0.70嗜盐真菌0.65嗜高渗酵母0.60

aw=P/P0

P为溶液蒸汽压；P0

为纯水蒸汽压

M的aw一般在0.60-0.99之间六、能量化学物质（化能营养型）有机物：化能异养型无机物：化能自养型辐射能（光能营养型）：光能自养和光能异养七、微生物的营养类型按碳源、能源、氢供体划分。划分依据营养类型特点碳源能源氢供体自养型异养型光能营养型化能营养型无机营养型有机营养型

CO2为唯一或主要碳源有机物为碳源光为能源有(无)机物为能源无机物为氢供体有机物为氢供体营养类型碳源能源氢供体光能无机自养型光能有机异养型化能无机自养型化能有机异养型

CO2有机物（或CO2）CO2有机物光能光能化学能(氧化无机物)化学能(氧化有机物)H2S、水、氢等;藻类、硫细菌有机物，如硫细菌;污水处理氢、H2S、氨等，如硝化细菌、硫化细菌等，物质循环有机物，真菌、原生动物，所有病原菌等注：区分是相对的。异养菌：有机物存在→可同化CO2

。自养菌也能利用有机物。条件变化→营养类型改变，如紫色非硫细菌无有机物：自养

；有机物存在：为异养；厌氧光照：光能营养；好氧黑暗：化能营养。第二节培养基人工配制，适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物所用的营养基质。一、配制培养基的原则二、培养基的类型及应用一配制培养基的原则目的明确营养协调

条件适宜经济节约1.目的明确：目的菌、营养类型、什么用。2.营养协调浓度合适，比例协调（如C/N）。如水＞C源＞N源＞无机盐＞生长因子。菌不同，C/N不同，细菌、酵母菌为5/1，霉菌为10/1。同一种菌，生长阶段不同，C/N也不同。如谷氨酸棒杆菌，菌体生长C/N为4/1；谷氨酸积累为3/1。3.条件适宜渗透压，pH，氧化还原电位和水活度。（1）pH细菌：pH7.0-8.0；放线菌：pH7.5～8.5；酵母和霉菌：pH4.5～6.0。调pH方法外源调节：1mol/L的NaOH和HCl溶液内源调节磷酸缓冲剂（KH2PO4和K2HPO4）：产生少量酸、碱时（pH6.4-7.2内起调节作用）。碳酸钙：中和培养过程中产生大量酸。培养基中天然缓冲物质：氨基酸，蛋白质。（2）氧化-还原电位（）量度还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势。不同微生物要求值不同。好氧：0.3-0.4V→提高通气量或加氧化剂；厌氧：+0.1V以下→加还原剂（抗坏血酸、Na2S等）；兼性厌氧：+0.1V→有氧呼吸，-0.1V→发酵。4.经济节约糖蜜（含蔗糖，制糖工业废液）乳清（含乳糖，乳制品工业废液）麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉等。5.附-灭菌处理121.3℃，15-20min或115℃，35min。不耐高温物质：先过滤除菌或间歇灭菌→混合。长时间高温→磷酸盐、碳酸盐+某些阳离子→沉淀。加EDTA，或分开灭菌→混合。6.常见的四种培养基培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基，pH7.0-7.2培养放线菌：高氏一号培养基，pH7.2-7.4培养酵母菌：麦芽汁培养基，自然培养霉菌：查氏培养基，PDA培养基，pH自然二、培养基的类型及应用（一）按成分来源划分（二）根据物理状态划分（三）按用途划分（一）按成分来源划分1.天然培养基优点：配制方便、营养多、经济。缺点：成分杂，不稳定，重复性差。例：肉汤、麦芽汁培养基。用途：研究和生产。2.合成培养基用途：研究。优点：重复性强。缺点：贵、烦琐、生长慢。例：高氏一号、察氏、葡萄糖铵盐培养基等。3.半合成培养基用途：广泛。例：马铃薯-葡萄糖培养基。（二）根据物理状态划分1.固体培养基（1）固化培养基液体培养基+琼脂（1.5-2%）或明胶（5-12%）。用途：分离、鉴定、活菌计数及保藏。（2）天然固体培养基（3）非可逆性凝固培养基血清凝固或用无机硅胶做凝固剂，不能再融化，培养致病菌。注：凝固剂有琼脂，明胶，硅胶。2.半固体培养基液体培养基+琼脂（0.2-0.7%），如明胶培养基。用途：观察细菌运动、噬菌体效价、厌氧菌的培养和保藏。3.液体培养基4.脱水培养基除水分以外，其他已配制好，如虎红培养基（孟加拉红+氯霉素）。（三）按用途划分1.基础培养基含所需基本营养物质。2.加富培养基

基础培养基+特殊营养物质(酵母膏,组织液,血液，血清等)。用途：培养苛刻菌，分离富集菌。3.鉴别培养基基础培养基+指示剂（与微生物代谢产物发生显色反应）→鉴别菌。名称指示剂代谢产物特征性变化用途酪素培养基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鉴别蛋白酶菌株H2S试验培养基醋酸铅H2S产生黑色沉淀鉴别产H2S的菌株伊红美蓝乳糖培养基伊红、美蓝酸反射：绿色金属光泽透射：紫色菌落鉴别大肠杆菌纤维素水解圈放线菌霉菌4.选择培养基

（1）根据特殊营养要求或理化抗性设计→分离菌种。（2）分类①加特殊营养物：如纤维素、蛋白质（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）；②加抑制剂青霉素+链霉素（抑制细菌和放线菌，分离真菌）；孟加拉红+链霉素+金霉素（分离真菌）；结晶紫（杀G+，分离G-）；苯酚或重铬酸钾（抑制细菌和真菌生长，低浓度对放线菌无影响）；制霉菌素（抑制霉菌和皮肤癣菌，分离细菌和放线菌）。5.其他分析培养基：分析化学物质（如抗生素、维生素）的浓度，或微生物的营养要求。还原性培养基：培养厌氧菌。组织培养物培养基：含宿主细胞，培养病毒、衣原体、立克次氏体和某些螺旋体等。第三节菌种分离及保藏技术一、纯培养分离技术固体分离技术、液体培养分离、单细胞分离及其选择培养基分离技术四种。注：四种技术相辅相成，互相联系。（一）、利用固体培养基分离纯培养1.稀释倒平皿法和涂布平板法(10X稀释法，取菌悬液+培养基)2.平板划线分离法

(连续划线,目的是使cell分散)3.稀释摇管法每只9ml无菌水涂布平板法稀释倒平皿法样品液取1mL样品1.稀释倒平皿法和涂布平板法注：无菌条件下操作；稀释倒平皿法：温度45-50℃，长在培养基表面和内部。涂布平板法：长在培养基表面。玻璃刮棒(涂布器)2.平板划线法3.稀释摇管法分离厌氧菌，稀释倒平板法的变通形式。过程含培养基的试管（50℃左右）；梯度稀释样品，摇匀冷凝。倒灭菌液体石蜡-固体石蜡混合物，培养。挑单菌落。（二）、液体培养基分离法挑较大细菌、原生动物和藻类。用液体培养基梯度稀释→培养。同一稀释度，若大多数试管没有菌生长（＞95%）→有菌生长的试管→纯培养物。（三）、单细胞分离法显微镜下直接挑取。难度与个体的大小成反比，藻类、原生动物易分离，细菌难分离。（四）、选择培养基分离法1.直接分离：样品中目的菌含量多时。2.加富分离：样品中目的菌含量少。样品液直接分离涂布平板法对氨基苯甲酸为唯一碳源9ml无菌水取1mL样品富集分离对氨基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基对氨基苯甲酸为唯一碳源无对氨基苯甲酸，不生长有对氨基苯甲酸，生长二、菌种保藏技术根据菌种特性和保藏目的进行保存。1.原则（1）选良种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢）（2）创造休眠环境如低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等。2.几种常用保藏方法方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法(斜面)冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效3.菌种衰退、复壮（1）衰退自发突变→丢失优良生产性状、遗传标记。①原因：基因突变，传代过多。②衰退表现菌落和细胞形态改变；生长慢，产孢少；抵抗力减弱；代谢物产量或寄生力下降。③防衰退方法控制传代次数；用不易衰退的细胞传代（如单核孢子）；选合适培养条件及保藏方法；（2）复壮①

狭义复壮:已衰退，找出未衰退个体。②

广义复壮:未衰退前，进行纯种分离、生产性能测定→提高性能。③复壮措施纯种分离：平板划线、涂布、单细胞挑取等。接入寄主内复壮；淘汰已衰退的个体（理化条件处理→杀死衰退个体）。4.国内外菌种保藏机构（1）任务：收集、保管→不死、不衰、不乱→研究、交换和使用。（2）菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

美国的典型菌种保藏中心(ATCC)

英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）练习题1.名词：生长因子、培养基、鉴别培养基、选择培养基、水活度、加富培养基、