液相色谱-脉冲安培依替米星检测

液相色谱（反相)-脉冲安培检测对硫酸依替米星的分析

一.摘要二.引言及基本介绍三.实验四.结果与讨论五.结论一.摘要一种对于依替米星纯度和含量的检测的方法是通过液相色谱-脉冲安培检测。流动相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通过稀NaOH溶液调节成pH3.4的乙腈溶液所组成。总分析时间不超过30分钟。本实验对于分离时不同的色谱参数也进行了调节，并运用这种方法对大量的硫酸依替米星的商业样品进行了分析。二.引言和基本介绍1.依替米星简介2.氨基糖苷类的检测方法3.脉冲安培检测（PAD）简介1.依替米星简介依替米星，是一个通过化学修饰庆大霉素的C1a而获得的新的半合成的水溶性的氨基糖苷类抗生素，对氨基糖苷类和类似的奈替米星耐药的革兰氏阳性和阴性菌均有活性。依替米星的耳毒性和肾毒性大体上比其他的氨基糖苷类低，比其他的奈替米星类更低（耳毒性为奈替米星的1/2，丁胺卡纳的1/7；肾毒性为奈替米星的1/12，丁胺卡纳的1/17）。然而，依替米星的治疗范围窄并且要小心得检测在血液中的水平。1.依替米星简介依替米星是庆大霉素的C1a的1-N-乙基衍生物。因此，庆大霉素C1a是可能的一种杂质。还有庆大霉素C1a的衍生物3”-N-乙基（ETM-1)和1,3”-N-乙基”(ETM-2)，和一些中间体如3,2,6-N-乙酰基-庆大霉素)和1-N-乙基-3,2,6-N-乙酰基-庆大霉素(P2)有微弱的抗菌活性。这几种物质就是下面的实验中进行检测的主要物质，结构式如下：1.依替米星简介2.氨基糖苷类的检测方法在过去的几年中出现了大量的检测氨基糖苷类抗生素的方法，包括微生物检测，免疫测定，毛细管电泳，薄层色谱法，气液色谱，利用紫外检测的柱前衍生化的高压液相色谱，电化学，质谱法。依替米星有氨基糖苷类的结构，以上提到的方法也应当可以运用。（有兴趣的话自己下去学）由于柱前衍生化是不方便的，耗时的并且定量的时候有一些问题或者导致不稳定的衍生，电化学检测尤其是脉冲安培检测是更好的。3.脉冲安培检测简介安培检测器由恒电位器和三电极电化学池组成。三电极就是工作电极、参比电极和对电极，在工作电极和参比电极之间施加的是发生氧化反应或者还原反应所需的电位，称为施加电位或者工作电位。在工作电位上施加阶跃电位的称为脉冲安培法。脉冲安培检测在实验中需要使用三阶电位，Εdet,Εoxd和Εred，因此必须设定各脉冲的幅度和间隔时间。3.脉冲安培检测3.脉冲安培检测简介可用于安培检测的物质需具有电化学活性，并较易发生电化学氧化还原反应。电化学检测灵敏度高，具有很好的选择性。特别是对于那些不具有紫外-可见或荧光生色团的物质的检测，脉冲安培检测是一个很好的补充手段。3.脉冲安培检测简介通常，溶液的pH值对电化学反应的影响很大，如果反应过程中有H+或者OH-的参与，其氧化还原电位和检测灵敏度将随pH值的不同而变化。当流动的酸碱度不能达到检测所需的最佳pH时，可在分离柱和检测器之间通过柱后加入适当的溶液进行调节，以保证检测的灵敏度。3.脉冲安培检测检测液相色谱-电化学检测技术不能取代常规的紫外-可见检测，但却是一个重要的补充手段，特别是那些不具有生色基团，不能用紫外-可见吸收有效检测的物质尤为需要。三、实验在这里主要讲实验中的色谱方法。流动相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通过稀NaOH溶液调节成pH3.4的乙腈溶液所组成。使用之前要用0.45微米的过滤器和超生进行过滤，流速是每分钟一毫升。所有被分析的物质都要溶解到流动相中。为了进行脉冲安培检测，0.52mol/L的氢氧化钠通过一个混合型三通从氮气加压水库加入到柱后并且混合到填充反应管。加入的酸的流速是不重要的，但他在流动过程中应该是重复的并且是没有脉冲的。将流动相的pH提高到大约13来增加检测的灵敏度是必要的。三、实验对于脉冲安培检测时间和电压参数设置如下：E1为0.12V;E2为0.70V；E3为-0.60V。t1为0-0.4秒；t2为0.41-0.60秒；t3为0.61-1秒。信号的整合是在0.2-0.4秒。四、结果和讨论1.色谱条件的选择2.波形优化和电极稳定性3.液相色谱的定量方面4.商业样品的分析1.色谱条件的选择分离依替米星和它的相关物质的不同色谱参数的影响用保留时间和分辨率进行评估。保留时间指被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用RT表示，常以分（min）为时间单位。保留时间是由色谱过程中的热力学因素所决定，在一定的色谱操作条件下，任何一种物质都有一确定的保留时间，有着类似于比移值相同的作用，可作为色谱定性分析的依据。1.色谱条件的选择在流动相中增加乙腈的数量和乙腈浓度的些许不同而使得保留时间减少有着显著的影响。为检查草酸量的影响，草酸在流动相中的浓度是按照下面的浓度进行变化的：0.025,0.028,0.033和0.036mol/L。在检查的范围内，草酸的量对保留时间没有显著的影响。用pH2.5—4.5的缓冲液来检测流动相pH的影响。pH在3-4几乎没有影响。随着进一步降低或者增加pH，保留时间就减少。（见下图）1.色谱条件的选择1.色谱条件的选择七氟丁酸的浓度在0.0074-0.015mol/L时对保留时间没有影响，随着七氟丁酸的增加，保留时间增加了很多。在柱温的影响方面检测了35,40和45度。正如预期的那样，当柱温增加的时候保留时间就减少了（和粘度有关，由于温度升高，粘度减小，所以保留时间减少）。2.波形优化和电极稳定性电流-电压的伏安响应曲线被用来筛选电压的检测操作条件。这些展示在下图中。（虚线是参比溶液，实线是依替米星样品）测依替米星时在金电极表面的氧化出现在0-0.4V。参比溶液在这个区域几乎没有阳离子电流。参比溶液的电化学响应是由于在E大于0.4V时表面氧化物的形成和E大于0.7V时氧气析出。循环的伏安数据表明依替米星的脉冲安培检测-液相色谱时工作电位应当设置到0-0.4伏。2.波形优化和电极稳定性2.波形优化和电极稳定性下图显示了背景的一个情节，依替米星的响应对应着测量工作电压。背景反应和依替米星反应的最大差出现在大约0.12V。这是工作电压在最后方法条件时的电压。检测时E1=0.12V的信号-噪声比是3250，这比其他检测电压时的比值更大。2.波形优化和电极稳定性2.波形优化和电极稳定性虽然理论上的电位序列清洗了电极表面，为获得好的重复性金的工作电极在分析60次后是有必要进行磨光的。在电极用精细抛光化合物清洗后，应当在水中超生10分钟。在同一时间用纸巾清除计数电极和参考电极的沉积物质是合适的。3.液相色谱的定量方面依替米星和相关物质的线性是在0.005-0.125mg/mL的浓度范围内检测出来的。结果在表1中。其中y是峰面积，x是注入标准溶液的浓度（mg/mL），r是相关系数。可重复性是分析0.05mg/mL的每一个化合物的标准溶液六次，峰面积的RSD在表1中。3.液相色谱的定量方面4.商业样品的分析三个商业的硫酸依替米星，从三个不同的产商获得，用所描述的方法进行了分析。将得到的样品的组分展示在表2中。所有较小的成分都用依替米星的相对数量来表示，用检测商业样品的百分之5的稀释液获得色谱图。结果发现ET2是主要的杂质，没有用其他的方法进行检测。可以看出，依替米星样品的组成是依赖于原始的样品的。同