第二章 DNA的复制

第2章DNA的复制、损伤与修复中山医学院生物化学教研室银巍yinwei@遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制控制性状的表达复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA本章主要内容：

复制的一般特征

DNA复制的酶学复制的过程逆转录和其他复制方式

DNA损伤（突变）与修复DNA复制DNAReplication第一节复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)复制的基本规律一、半保留复制是DNA复制的基本特征DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合式密度梯度实验:——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14

DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制复制中的放射自显影图像A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC复制中的DNA复制原点复制叉真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)

。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(laggingstrand)

。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。复制叉（replicationfork）DNA复制的酶学第二节TheEnzymologyDNAReplication参与DNA复制的物质:底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPiDNA链的延伸（ElongationofaDNAchain）聚合反应的特点:DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶功能：DNA-polⅠ(109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。ArthurKornberg

1918StanfordUniversity

Stanford,CA,USATheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

Large(Klenow)fragmentofDNApolymeraseIDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。亚基（130000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用核心酶由、和亚基组成：DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。功能：-复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基（DNA夹子）加载于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力。-复合物由6种亚基组成：、、、、、（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol真核生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。（一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNApolⅠ的校读功能（二）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。DNA聚合酶具有监控进入的dNTP配对的能力。DNA聚合酶还能够区分rNTP和dNTP，DNA聚合酶的活性中心对rNTP有空间排斥作用。DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成只有当正确的碱基配对形成之时，引物的3-OH和进入的dNTP的-磷酸基团才能处于适当的位置，发生催化反应，形成3,5-磷酸二酯键。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态在研究复制时，将与复制有关的蛋白质命名为：

DnaA,DnaB,DnaC,‥‥‥DnaX

将相关的基因命名为：

dnaA,dnaB,dnaC,‥‥‥dnaXMapoftheE.colichromosome解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成既能水解、又能连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶的作用：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列53531.DNA解链MapoftheE.colichromosome复制起点的一般特征:①由多个独特的短重复序列组成。②短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。③一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链DNA复制模板。DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白协助DnaB在多种蛋白质参与下，DNA解开成单链SSB维持单链稳定E.coliDNA复制起始

Dna盒DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol先导链或领头链(leadingstrand)

顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。5’3’3535解链方向复制的半不连续性3535解链方向复制方向与解链方向相反，须等待解开足够长度的模板链才能继续复制，所得到一条由不连续片段组成的子链。后随链或随从链(laggingstrand)

冈崎片段（Okazakifragment）3’5’3’3’5’

在复制叉同时合成前导链和后随链原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。与Tus蛋白结合，形成Tus-Ter复合物，阻止复制叉前进。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接：真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。

复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（二）端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒酶参与解决染色体末端复制问题前导链产生完整的子染色单体。后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒的功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNaseHⅠ和FEN1等。真核生物与原核生物DNA复制的差异：逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四节双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。一、线粒体DNA按D环方式复制环形、双螺旋DNA分子两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（L链）dNTPDNA-polγ

线粒体DNA分子特点：有特异的复制起点；环形线粒体DNA两条链（H和L）的复制不同步D环或取代环（displacementloop）：线粒体DNA复制开始以H链作为模板合成新的L链，取代原来的L链并和H链互补，而原来的L链则保持单链状态，形成类似英文字母D的区域；两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；线粒体DNA复制也需要RNA引物。线粒体DNA复制特点：二、噬菌体DNA按滚环方式复制环形双螺旋DNA分子；一条为模板链，另一条为非模板链。E.coli噬菌体DNA的分子结构特点：仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝；噬菌体DNA复制的方式是滚环复制。噬菌体DNA复制特点：噬菌体DNA复制首先由它自己编码的A蛋白在非模板链上造成缺口，再以所产生的游离3端羟基作为引物，并在宿主细胞的DNA聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新链，新链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称为滚环复制。滚环复制：3-OH5-P55533335'滚环复制5'5335+-双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条链同时复制，也可能利用一条链作为模板起始DNA合成。双螺旋DNA的两条DNA链的复制起点也可能处于不同的位置。滚环复制和D环不对称复制的存在说明：逆转录Reversetranscription

因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家鸟类Rous肉瘤病毒（RSV）感染正常细胞肿瘤DNA合成抑制剂转录抑制剂逆转录病毒RNA基因组和原病毒逆转录病毒感染哺乳动物细胞及其整合到宿主染色体Retroviralinfectionofamammaliancellandintegrationoftheretrovirusintothehostchromosome.逆转录病毒在宿主细胞内经历原病毒再借助宿主RNA聚合酶转录、包装而繁殖（一）逆转录合成双链cDNA（二）双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和逆转录病毒RNA基因组相对应的双链DNA序列。逆转录病毒（retroviruses）：RNA病毒，含有逆转录酶逆转录：在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。RNA指导的DNA聚合酶活性；DNA指导的DNA聚合酶活性；RNAseH的活性是指它能够从53和35两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。逆转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA逆转录酶有3种酶的活性：逆转录病毒细胞内的逆转录现象：

RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA*逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶碱水解TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，合成DNA以mRNA为模板，逆转录合成与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为cDNA

complementaryDNADNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第五节DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础自发突变/自然突变

（二）突变导致基因型改变没有可察觉的表型改变个体之间基因型的差别称为多态性（polymophism）（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础dbSNP—单核苷酸多态性数据库，包括SNPs，小范围的插入/缺失，多态重复单元，和微卫星变异。DbSNP包含种族特异的频率和基因型数据，实验条件，分子上下文，及中性多态和临床变异的定位信息。OMIM—在线人类孟德尔遗传—约900个OMIM记录的等位变异二、引发突变的因素物理因素：紫外线、各种辐射

UV胸苷酸二聚体的形成化学因素：常见的化学诱变剂化合物类别作用点分子改变碱基类似物如：5-溴尿嘧啶5-BUA5-BUG-A--T--G--C-羟胺类（NH2OH）TC-T--A--C--G-亚硝酸盐（NO2）CU-G--C--A--T-烷化剂如：氮芥类，NitrominsGmGDNA缺失G运用沙门菌检测致癌物：组胺酸异样的沙门菌胞壁缺陷同时修复系统不活化a:接种在无组胺酸培养基中只有少数细菌生长；b-d:等量细菌接种到同样培养基中，每盘中央放置由高到低梯度浓度的含待测样品的滤纸，诱变剂可以提高回复突变率，因而增加菌落的生长。多种化学或物理因素造成细胞DNA损伤碱基丢失碱基改变核苷酸插入或缺失DNA链断裂DNA链间共价交联DNA损伤类型三、突变的类型（一）点突变（pointmutation）——指DNA分子上一个碱基的变异发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1、转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。2、颠换正常成人Hb(HbA)N–pro·

glu

·glu·

·

·

C镰形红细贫血病人Hb(HbS)N–pro·

val

·glu·

·

·

CCT

CGAGCACGTG（二）缺失（deletion）、插入(insertion)缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。谷酪蛋丝5’

……G

CA

GUA

CAU

GUC

……丙缬组缬正常5’……GA