体内药物分析

缀合物：缀合物类型：①葡萄糖醛酸苷：含-OH、-COOH、-NH2、-H等功能团的成分可与葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物②硫酸酯：芳胺、酚类及醇类成分可与硫酸形成硫酸酯缀合物血浆蛋白结合率：反映了药物与血浆蛋白的亲和程度。一般指在治疗量时药物结合的百分率，作为药代动力学的重要参数之一，影响了药物在体内的分布、代谢、排泄，与药物的药理作用强度密切相关。一相代谢：氧化、还原、水解反应。在药物结构中引入羟基、羧基、氨基等官能团，为二相代谢做准备二相代谢：结合反应。具有羟基、羧基、氨基等官能团的药物与糖、硫酸盐、氨基酸等结合，极性增大，利于排肝内代谢反应类型：以氧化为主，其次为还原、水解结合肠内菌的生物转化：利用肠内菌微生物中特定酶将中药成分（或天然化合物）进行生物转化，属单酶或双酶的高密度转化。具有高度选择性（尤其是立体选择性）和反应条件温和的特点。以水解反应为主，其次为氧化还原反应。•蛋白质的去除：沉淀法（有机溶剂沉淀法、盐析法、酸性试剂沉淀法、加热沉淀法）；酶消化法；超滤法、透析法、微孔滤膜过滤法。•影响液相提取的因素：提取溶剂；水相PH值（根据待测成分PKa；为保证提取率的重现性，常使用缓冲溶液）；离子强度（越大提取率越高）•影响固相提取的因素：合适的洗涤剂和洗脱剂；流速（不宜过快）；上样量（样品突破性实验可判断上样量是否超载）•固相提取的操作步骤：固相柱选择、处理一样品上样一分离纯化一洗脱待测成分一浓缩处理或直接进样分析•检测限和定量限LOD&LOQ的确定和要求：LOQ【能从背景信号中区分出药物时所需样品中药物的最低浓度】可于空白生物基质加入定量的药物标准品混匀，配制成药浓在标准曲线末端并逐渐降低的一组药品，然后对每种浓度测定3〜5次，以测定结果的精密度达到W20%和准确度达到W+20%时的样品中药物的最低浓度。LOD【保证具有一定可靠性前提下，分析方法能测定出样品中药物最低浓度】-测定时记录各浓度样品每次测定得到的药物信号强度S与噪音/背景信号强度N,然后取均值S、N,以能达到S/N=3时样品药浓为LOD。•提取回收率的操作与要求：往空白生物基质或含药物的样品中加入的药物标准品已知量A,实际上是准确加入已知浓度的药物标准品溶液一定体积，使两种考核样品内含总药浓应包括高、中、低三种（浓度接近最高、平均、最低药浓）。每个浓度应测定多次（3〜5），并且几次测定值M的相对标准差应符合“内标法中内标物回收率与待测物不相差10%”的要求，然后取均值M•透析法影响因素：透析膜对药物的吸附；donnan效应；缓冲液体积变化。分析常用生物样品的种类和特点a・血样①常用于药代动力学、生物利用度、血药浓度检测②包括全血、血浆和血清，其中血浆和血清常用③全血加抗凝剂，离心后分取上清液得到血浆④全血在纤维蛋白原等作用下引起血块凝结析出，离心后取上清液得到血清⑤常用抗凝剂有肝素、钙结合剂EDTA、枸缘酸钠、草酸钾、氟化钠等。常用肝素⑥制备血清时血块凝结，易造成成分吸附损失⑦抗凝剂的选择可影响测定结果b・尿液①常用于成分代谢研究②尿液样品量大，待测成分浓度高、变化较大、与血液的成分浓度相关性不强⑤短时间内不可能多次取样，不易采集完全c・唾液①可用于药代动力学和药物浓度监测②唾液中成分浓度通常与血浆浓度相关。一般低于血浆浓度且变化较大，但二者存在恒定的比例关系③采集不受地点、时间限制，易获得④许多用于血浆测定的方法稍加改进即可用于唾液测定⑥组成受各种因素影响较大，且个体差异较大d・脏器①用于研究成分在各器官、组织的分布、积蓄或代谢情况②脏器组织可与成分形成强烈结合③在分离分析前，需预先制成1:5或1:10的匀浆，以提高溶剂抽提率，降低组织空白值，避免乳化2・体内分析常用生物样品的采集和贮存方法；采集：必须有代表性，应力求取样条件标准化，包括摄取标准膳食，控制饮水量等。保存：①血浆、血清：尽快从全血中分离，一般不超过24小时，冷冻贮存②尿液：采样后立即加入防腐剂（甲苯、氯仿）室温保存或冷冻贮存③脏器组织：-20°C冷冻3・生物样品的常用保存方法：冷冻贮存①短时间内分析的样品，4C冷藏②放置数日或更长时间的样品-20C③冷冻样品测定时，须临用前解冻，并在解冻后一次性测定完毕，不宜反复冷冻解冻，否则会导致成分含量下降；B.加稳定剂①加入酶活性阻断剂：氟化钠（常用，可抑制血清酯酶，并抗凝防腐）四氢尿苷、三氯酸钠②加抗氧剂VC；C.加防腐剂：尿液中加甲苯（每100ml尿液加1ml充分振荡混匀或加在尿液表面形成薄层）、氯仿（加少许摇匀使其饱和，瓶底留少量氯仿）等；D.调pH值：加无机酸或碳酸钠改变尿液酸碱度，可抑制细菌生长5・体内分析方法设计思路和建立步骤、评价指标和方法。研究思路：①样品：中药水煎剂②实验动物：犬猪③给药途径：口服④含药血清：不同时间点含药血清（时效曲线）血清药理学研究（药效机理）⑤相关分析：体内直接物质接触，原型成分，代谢产物药物分析方法评价指标：准确度、精密度、检测限和定量限、专属性、药物稳定性、标准曲线、重复性、耐用性、样品测定（QC样品）1•准确度：A.回收率⑴提取（萃取/绝对）回收率测定方法①对比法②标准曲线法；⑵相对回收率：回收试验法、加样回收试验法。2・精密度：（测定结果与平均值的偏离程度）将分析后剩余样品混合成含药浓高中低三种，测定时对每种重复测定3-5次，并且每次应从取样开始至测定完成后得到的结果。将得到的测定值分别算出高中低三种药浓样品测定结果标准差和相对标准差RSD。3•灵敏度：【LOD+LOQ】光谱分析和免疫分析可测定4-5份空白生物样品的信号强度（光吸收度，荧光强度或放射性强度）以均值作为N,色谱分析可用空白样品按样品分析方法制备的溶液进样，记录空白色谱图。取相当于药物峰宽W20倍的一段基线，且范围应相当于药物峰最后一段，实际测定时刻增加记录仪灵敏度，放大此段基线，然后以偏离基线平均噪音水平最大峰高的一半作噪音值，且应重复几次，用得到的均值N计算信/噪比S/N4・专属性5・线性与范围：标准浓度应包括一定梯度的5-8个浓度（等比关系，非线性者如免疫分析可适当增加），每个浓度只需测定一次（免疫分析可测定两次并取平均）。一般浓度上限为样品最高浓度的120%，下限为样品最低浓度的80%但高于LOQ。在舍弃点时，应从两段舍，保证r合格（r>0.99,制剂分析HPLC：r>0.999）•专属性specificity的操作与要求：1.生物基质的影响【要求】：可取3个以上不同个体的空白样品，考察正常生理情况下样品中生物基质的影响。色谱分析：要求药物与内标峰附近无干扰峰；光谱分析：要求药物测定波长处无杂质吸收（或无杂质荧光）；免疫分析：应比较同量药物加入空白体液和缓冲液中测值的差异，并尽量用参比方法（如色谱法）作对比。2.药物代谢物的影响3.配伍药物的影响4.参比方法对照【操作】：一般选用专属性强，准确度高的色谱法进行对照。在对照比较时，通常是将同一批含药浓度不同的药品，用待考察方法测得浓度为纵坐标y,参比方法为x，并且坐标标度相同，如此做成相关性图。回归方程为Y=a+bX,其中b表示测定结果相关性。等同线Y=bX（b=l）为等同线线性方程，表示两方法测定结果完全相等。若回归线越接近等同线，则待考察方法越接近参比方法；若b越接近1（a很小时），则考察方法越等同于参比方法。体内药物分析：体液药物分析、生物药物分析，满足临床药学、临床药理学的发展和需要，通过各种分析手段，了解药物的体内过程药物代谢：药物吸收和分布之后在血液或组织中的生物转化过程。是沟通药物化学和药理学的桥梁。代谢产物：生物转化的产物。生物转化：药物在生物体内的化学反应质控样品：于空白生物基质中加入不同浓度的药物标准溶液，配置成含药物高中低三种已知浓度的QC样品，并在稳定条件下贮存。每个浓度应测定两次，要求得到6个测定值中至少4个落在已知浓度的±20%范围内，以此作为判断本次样品分析合格的标准中药成分体内分析意义（一） 进行中药血清化学和血清药理学研究，阐明中药体内直接物质基础及其作用机制的重要技术基础。中药学清化学和中药学清药理学为中药体内代谢研究的发展奠定了基础。中药体内代谢研究的发展为中药血清华夏和中药血清药理学的研究内容提出了更高的要求。三者相辅相成将会对中药作用物质基础复杂性和作用机制复杂性的阐明提供关键的科学依据和方法、手段，为中药现代化研究提供开拓性思维和方法。（二） 中药成分生物转化和代谢研究是新药设计发现和创新的重要途径。①吸收不良导致新药开发失败或成本增加②肠内菌对药物结构的生物转化、肝脏药物代谢酶对药物结构的修饰导致药物失效④不良的药代动力学参数、生物转化或代谢产物产生毒性导致新药开发失败⑥药物代谢酶基因多态性导致药物效果的个体偏差和应用受限•合理的药物设计应该充分考虑药物代谢途径及相关代谢特征，找出先导化合物的代谢hotspot通过对药物生物转化或代谢的有益发现，实现对先导药物的化学结构改造，以改善药理作用，提高疗效，降低毒性或增加稳定性①体内不代谢或仅经水解酶代谢的新药设计②对药物分子进行结构修饰以防止其失活的新药设计③合成有效代谢物或模拟有效代谢物结构的新药设计④仿生药物转化的新药设计⑤据肝脏细胞色素P450代谢特点的新药设计•从天然药物生物转化和代谢产物中筛选新药更有利于新药的源头性创新其理想程序为：中药-人种药理学为先导-先导化合物-物理化学性质-体外ADME-体内ADME-毒性评价-可接受先导化合物-候选药物-创始性药物天然组合化合物库/组合代谢产物库-高通量筛选-活性再评价（三）药物评价的重要内容和技术基础：药代动力学、生物利用度、安全性（四）临床药学和临床药理学赖以建立和发展的技术基础和实验手段特点：干扰杂质多，样品量少浓度低，不稳定性，要求快速提供结果第一节中药成分在生物体内的存在状态一、 药物体内过程：吸收一血浆（D+P—DP药物-蛋白复合物）、受体（作用部位：R+DoRD）、组织（贮存：D+ToDT）生物转化（D+E药物代谢酶oM代谢物）一排泄二、 中药成分体内存在状态包括原型成分，原型成分经生物转化生成的代谢产物，以及二者与生物大分子（如蛋白质、受体）的结合物。在血液中只有未同蛋白质结合的游离药物才可以从血液自由的透过细胞膜，到达作用部位而发挥疗效。药物与蛋白质的结合能减慢药物从循环血液中的消失，起到药物库的作用。三、 药物与血浆蛋白的结合药物通过体液输送到器官、组织，在体内转运、转化过程中，可与组织蛋白（包括受体）和体液蛋白结合。因此研究药物与体液蛋白的结合非常重要。在常见的体液样品中，血浆、血清富含血浆蛋白。由于血浆、血清主要生化成分相近。二者均可作为分析样品并常常能互相代替。D药物+P血浆蛋白oDP药物-蛋白复合物：药物主要与白蛋白（清蛋白，血浆主要蛋白质，占总量的一半）结合，极性小的脂溶性药物可与脂蛋白结合可逆性：药物与血浆蛋白的结合主要通过非共价键力，即依靠分子键氢键、范德华力等。因此是可逆过程，离解速度很快;非特异性：血浆蛋白能和很多药物结合，多数酸性药物与血浆白蛋白结合，碱性药物除与白蛋白结合外，还能和酸性糖蛋白结合;竞争性：两个药物竞争血浆蛋白的同一结合部位，结合率高的可置换出结合律低的药物；药物的代谢产物也能竞争性取代与蛋白结合的母体药物。另一方面，部分药物也可以促进血浆蛋白对另一药物的亲和力四、 血浆蛋白结合率及其测定结合平衡后，血浆中药物总浓度（C总）分为两部分：与血浆蛋白结合浓度（C结合）和游离血药浓度（C游）蛋白结合率=C结合/C总=（C总-C游）/C总（一）透析法：将血清置于透析管中，悬于含药物的缓冲液中，在一定温度下静置或持续震荡数小时，达到平衡后，透析管内外游离型药物浓度相等，而管内除含有游离型药物外，还保留了药物与蛋白质的结合物（结合型药物）计算：测定管外溶液中药物浓度（游离药物浓度）和管内药物总浓度，两者之差即为与血浆蛋白结合的药物量。由此可计算出被测药物的血浆蛋白结合率。蛋白结合率=（管内药物浓度-管外）/管内注意：1•透析膜①型号选择：由醋酸纤维素制成，应根据截留分子量的大小选择。②检漏：加3%CC13COOH是否有沉淀③保存方法：新的干燥透析膜应保存在密封的聚乙烯袋中，以防止受潮生霉。湿的用1%苯甲酸钠或0.05%叠氮化钠溶液防腐5°C保存。经处理或使用的透析膜不允许其再次干燥，应保存在50%甘油或乙醇中。2•预处理：①透析膜通常含10%水25%甘油0.1%硫化物。一般透析时只要浸泡润湿并用蒸馏水充分洗涤，即可使用②硫化物去除：用10mmol/L碳酸氢钠浸洗，用50%乙醇浸泡或煮沸③微量重金属去除：10mmol/L的EDTA浸泡蛋白质溶液：多用人或动物的血浆，也可用白蛋白。一般用牛血红蛋白3•缓冲溶液：磷酸盐缓冲液（pH=7.4-7.5）浓度0.1-0.2mol/L当药物含有羧基或酚羟基时，磷酸盐缓冲液浓度不能太高或太低，一般应加入适量中性盐，如0.15mol/L氯化钠4•平衡温度与时间：常用37°C/4°C/20°C,为缩短平衡时间，可采用震荡平衡法，必要时需加适量防腐剂。平衡确定方法：取与血浆样品液相同体积的透析液，放入另一只透析管中作对照，确定药物管内外自由扩散达到平衡的时间5.影响因素①透析膜对药物的吸附。检查方法：透析管内先盛入缓冲液（VI）管外加入已知药物浓度为CA的缓冲液（V2）达到平衡时，测定管外药物浓度CE，若符合CEvCAV2/（Vl+V2）则说明透析膜对药物有明显吸附，应进一步考察在不同浓度下药物与半透膜的吸附程度，若吸附力与药物浓度相关，则应当用相关曲线予以校正②donnan效应：如果药物带电荷，蛋白质也带电荷，因电荷影响，可造成平衡时透析膜两侧游离药物浓度不等。一般用高浓度缓冲液或中性盐溶液作为透析液时可消除该反应。但当溶液pH值偏离蛋白质等电点太远，且蛋白质浓度较高时，用高浓度缓冲液也不能消除时应考虑对该效应进行校正（二） 超滤法：用超滤膜将结合型药物和游离药物分离。超滤装置：用超滤膜将超滤装置分为上下两部分，膜上为贮样室，下为收集管。装样后离心强迫游离药物随血浆中水分以及其他小分子物质通过超滤膜影响因素及注意事项：超滤膜的选择；超滤速度：3000-10000转/分；超滤时间：5-15分；温度：4/20/37C；超滤液体积：控制超滤后/超滤前体积比为0.3-0.6，因蛋白质浓度变化会引起药物蛋白结合率变化（三） 凝胶过滤法：将血浆样品溶液通过葡聚糖凝胶住，将游离型药物与结合型药物分离。只用于测定与蛋白结合率高的药物。注意选择凝胶类型，柱温，洗脱液种类，洗脱流速等。凝胶柱：常用葡聚糖凝胶类型有G-25/G-50/G-125。柱温：20-37C。洗脱液：一般为缓冲液，如pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液，也有用5.5的缓冲液洗脱酸性药物。洗脱流速：0.3-1mL/min（四） 超速离心法：将血浆或血清直接加入离心管，高速离心（150000-250000rpm）下离心分离，上清液含游离型药物，沉淀含结合型药物。注意分离过程中存在反扩散现象，溶液粘度影响分离效果，上清液中残存蛋白的影响（五） 将白蛋白微球悬浮在缓冲溶液中，倒入底部具有孔板的注射器内，加入药物混匀温敷一定时间，推注注射器活塞，游离药物随缓冲液通过孔板滴入收集器。此法在一定程度上可反映药物的血浆蛋白结合率（白蛋白约占血浆蛋白的60%）第二节肠内菌的生物转化一、 水解反应：肠内进行的主要生物转化反应，由肠内菌具有的B-葡萄糖苷酶、B-鼠李糖苷酶、B-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶等催化完成。将苷在苷酶作用下转化为苷元。二、 氧化反应：肠内菌对中药成分的氧化生物转化，最典型的例子是黄酮类化合物。不同类型黄酮类化合物由肠内菌氧化转化引起的骨架开裂具有一定规律性。A.黄酮一C6-C3型酚酸；B.黄酮醇一C6-C2型酚酸；C.二氢黄酮一C6-C3型酚酸；D.异黄酮一乙基酚衍生物；E.黄烷醇一C6-C3型酚酸（经过苯基-B-戊酸内酯中间体）；F.花色素一C6-C1型酚酸三、 还原反应：硝基还原酶和亚硝基还原酶，肠内菌含有丰富，而肝脏不含有。其他还原酶如3B-羟基甾体脱氢酶四、 异构化反应：光学活性和立体选择性转化五、 含氧化合物向含氮化合物的转化：肠内菌可使某些含氧化合物转化为含氮化合物，其中氮元素来源于肠内菌氮代谢产生的氨。环烯醚萜类化合物主要存在该转化。六、 脱酰基化（酯解）作用：肠内菌中含有酯酶，可进行~七、 酯化作用：与酯解作用相反，某些肠内菌也能将自身胞壁组成成分脂肪酸与药物结合产生新的酯，如乌头碱的肠内菌转化。八、 聚合作用：当某些中药成分生物转化中间体反应活性较高时，它们之间也能聚合形成稳定的终产物，如紫草素的人肠内菌转化第三节肝脏代谢和生物转化亲脂性化合物虽然易于透过细胞膜被消化道吸收，但不易从肾脏排出，堆积体内造成毒害作用，只有经肝脏等器官的氧化还原水解结合等一系列代谢反应转为极性大的化合物，使之易于排出体外。大部分药物的肝脏代谢是灭活过程。个别药物的肝脏代谢可增强活性，如吗啡。一、 药物代谢的氧化反应：最重要最普遍。某些氧化反应由线粒体和细胞之中的脱氢酶或氧化酶催化；大部分氧化反应由肝脏线粒体单加氧酶末端酶系细胞色素P450催化C-烷基的氧化:①被单加氧酶将末端甲基及其临危亚甲基氧化，生成相应醇，多数情况下醇继续被脱氢酶氧化，转化为相应的羧酸或酮②若短链甲基和乙基烷烃直接结合到双键和芳香环上，结合部位容易氧化③甲基、亚甲基和次甲基的氧化活性依次降低N-烷基的氧化：微粒体FAD-单加氧酶（胺氧化酶）催化许多化合物中的N氧化，催化仲胺的羟基化和叔胺、羟胺的氧化。伯胺：首先生成羟胺，再继续氧化成亚硝基和硝基化合物。仲胺：氧化成羟胺再进一步生成不稳定的氮羰化合物，后水解成醛和一元羟胺。叔胺：氧化生产N-氧化物。脂肪环的羟基化：脂肪环化合物由于具有亚甲基结构，同直链状烷烃一样抑郁氧化代谢。芳香环的氧化：芳香环上的氢被羟基取代是芳香环氧化的特征，又称羟基化反应。电子密度高的部位优先氧化双键的氧化：双键临危的亚甲基易于被氧化代谢，但双键本身也能够被氧化代谢生成环氧化物。在生物体中形成的该类环氧化物可迅速被存在于肝微粒体或肝细胞可溶部分的环氧化物水解酶分解。环氧化物常与生物体内源性大分子蛋白质以及核酸等共价结合，导致组织坏死和癌变二、 药物代谢的还原反应：能够进行还原反应的官能团有硝基、偶氮基、羰基、烯基、N-氧化物、S-氧化物、环氧化物、过氧化物等。醛-酮还原酶：羰基化合物（醛、酮）羰基变为羟基。硝基还原酶：芳香硝基化合物变为芳胺，偶氮化合物变为胺。三、 药物代谢的水解反应（一） 环氧化物的水解。环氧化物的环氧三元环应力大，反应性强，可与多种生物体成分发生亲电反应而使细胞坏死、突变、癌变。生物体防御这种有害反应发生的酶类有环氧化物水解酶，将环氧化物催化为反式邻二醇。（二） 糖苷键的水解：糖苷键水解是糖和苷类化合物进入生物体后最普遍的反应。口服给药，水解反应主要发生在胃肠道内。静脉给药，主要发生在肝脏和肠肝循环。（三） 酯基的水解：能够水解酯键的酶称为酯酶。（四） 酰胺基的水解：能够水解酰胺键的酶称为酰胺酶。酰胺酶和酯酶没太大区别，但酰胺酶水解慢。四、 药物代谢的结合反应：药物经过第一相的氧化、还原水解等生物转化，代谢物进入第二相与生物内源性分子如葡萄糖醛酸、硫酸盐、磷酸盐、甘氨酸或其他氨基酸、硫氰酸盐结合或乙酰化、甲基化等，生成水溶性的无药理作用（一般来说）的产物，从尿液或胆汁排出。使极性增加：葡萄糖醛酸、磷酸、氨基酸、谷胱甘肽结合反应；氨基酸结合反应：甘氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等与游离羧基结合。谷胱甘肽结合反应受谷胱甘肽转移酶催化。五、 甲基化反应：有O-/N-/S-甲基化反应，分别由O-/N-/S-甲基转移酶催化。六、 乙酰化反应：含氨基药物，由乙酰基转移酶催化完成。以氧化反应为主。属底物非专一性反应，反应底物种类多。代谢产物极性、水溶性增大。代谢反应竞争性与序列性并存、相互交叉、代谢反应是多因素综合作用的结果。第四节体内分析样品制备三、生物样品预处理目的：使待测成分处于缀合状态；考虑因素：待测成分的酸碱性、极性、稳定性、蛋白质结合度；浓度高低、分析方法；生物样品性质四、蛋白质的去除A・沉淀法：a.有机溶剂沉淀法：①常用有机溶剂有乙腈、丙酮、乙醇、甲醇等，沉淀蛋白的效力递减②用1-3倍体积的有机溶剂可使90%以上蛋白质沉淀。b.盐析法：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠。c.酸性试剂沉淀法：常用酸性试剂：三氯醋酸（最常用，但常含杂质，只是有些方法的空白值偏高，其次是出去蛋白质后如采用乙醚为提取溶剂，三氯醋酸会融入乙醚干扰测定）、高氯酸、苦味酸等。d.加热沉淀法：适用于样品对热稳定者酶消化法：①在温和的理化条件下，水解生物蛋白，将与蛋白结合的成分释放，对蛋白结合率强的成分可显著改善回收率②避免成分在强酸下水解和较高温度时降解③采用HPLC检测时，无须进行过多净化操作④常用的蛋白水解酶有枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶⑤枯草菌溶液（细菌性碱性蛋白分解酶）最常用，pH7.0-11.0内使蛋白质降解，50-60°C活性最大⑥加入蛋白酶激活剂可减少酶用量和缩短活化时间，如咖啡因与胃蛋白酶合用氯化钙与胰蛋白酶合用C・超滤法、透析法、微孔滤膜过滤法：①与蛋白结合的待测成分未能被解脱出来而不能检出②用于测定血清或血浆中游离待测成分的浓度4・缀合物（结合物）水解A・酸水解：①通常用无机酸②酸浓度、水解时间、是否加热等条件随成分而异③简便快速，但与酶水解相比专一性较差④注意成分在水解过程中是否发生分解B・酶水解：①常用水解酶有葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，在世界应用中多用混合酶②水解方法：pH4.5-7条件下加入酶，37C厌氧条件下温育16小时③尿液采用酶水解，需预先出去尿中能抑制酶活性的阳离子④优点：专属性强，条件温和，不易引起待测成分降解⑤缺点：用时长，用量大，酶制剂可能引入粘液蛋白等杂质，使缀合物乳化造成层析柱阻塞C・溶剂解：某些成分的硫酸酯，可在萃取溶剂的作用下发生分解四、生物样品提取净化1.液相提取（液-液提取）提取率（萃取率）在体内成分分析中，由于样品量少且成分含量低，待分析样品数量较多，通常不采用反复提取的方法，多进行一次提取，因此成分提取率不可能太高，就一般分析而言，提取率不低于50%影响提取率的因素：提取溶剂①理想的提取溶剂对待测成分应具有大的亲和力；与水不互溶；不影响分析检测；化学性质稳定；沸点适宜，价廉无毒②为了减少容器对待测成分的吸附损失，提高提取率，可在非极性提取溶剂中加少量醇水相pH值①对于酸碱性成分的提取率影响很大②pH的选择主要根据待测成分的pka决定。一般来说，碱性成分的最佳pH应高于pka2-3个单位；中形成反可在任一pH条件下被提取,但以在pH偏高的情况下进行提取最好③为保证提取率的重现性，多采用缓冲溶液，以保持在提取过程中溶液pH稳定离子强度：①离子强度增加（盐析）有利于提高提取率②采药离子盐析效率由大到小：MgCaSrBaLiNaKRbCs阳离子；枸缘酸根、酒石酸根、硫酸根、AcCl硝酸根氯酸根ISCN阴离子提取技术：①通常不采用反复提取，多半进行至多两次提取，在用酸碱回提时也只进行一次，一般不考虑提尽药物②提取溶剂必须精确加入，提取液要定量分出，其他操作应与建立标准曲线时相同，并进行平行操作③多采用内标加入法，即在样品提取前，在各样品中加入等量内标物，以待测组分响应值与内标物响应值之比对浓度作标准曲线，进行定量④有机溶剂与水相的体积比一般为1:1或2:1⑤混合方式：密塞情况下振荡器振荡，涡动混合器旋摇或首尾颠倒混合⑥玻璃容器表面会对成分产生吸附，为减少吸附可在提取溶剂中加少量异戊醇、二乙胺等，或对玻璃仪器进行硅烷化处理离子对提取法的提取条件反离子①烷基或芳基磺酸盐、无机酸根等；用于呈阳离子状态的成分②4-12个碳原子的烷基胺类；用于呈阴离子状态的成分或代谢物，如酸性成分萃取溶剂：常用氯仿、二氯甲烷水相pH值①对离子对萃取有很大影响②最适宜pH应使成分完全解离③为保证提取率的重现性，多采用缓冲溶液,以保持在提取过程中溶液pH稳定离子对提取方法的应用①适用于高度店里的亲水性强的极性化合物提取，如尿液中水溶性大的缀合物②用于生物样品中痕量成分的提取有独到之处2．固相提取（液-固提取）固相柱亲脂型：活性炭、氧化铝、氧化镁、硅胶、键合相硅胶（烷基键合相、苯基键合相、氰基键合相）大孔吸附树脂亲水型：纤维素、硅藻土、硅胶（原理：分配作用，用与水不相混溶的有机溶剂洗脱亲脂性待测成分，亲水性杂质被滞留在固定相支持物上）离子交换型①阴离子交换树脂：在中性、碱性条件下用于弱酸性成分②阳离子交换树脂：在中性、酸性条件下用于弱碱性成分填料：①形状：子弹型、针筒型②规格：填料量0.05-10g不等；体积1-60ml不等根据样品体积大小，被测成分的含量及理化性质选择①一般样品体积小于1ml选用1ml固相柱；1-250mlf3ml；快速萃取时，选用6ml固相柱②被萃取成分量一般不超过填料量的5%⑴反相柱：先用固定相6-10倍量体积的甲醇或乙腈冲洗，湿润固相填料，使其溶剂化，然后用6-10倍量体积的水或缓冲液冲洗（此溶剂的极性、pH、离子强度应与样品液相似）使其达到良好的分离状态⑵正相柱：采用固定相6-10倍量体积的非极性溶剂冲洗（通常用样品溶剂来处理）⑶离子交换固定相：一般用水或弱缓冲溶剂处理将样品溶于弱溶剂（如缓冲溶剂）中，缓慢加到固相柱上用强度适当的弱溶剂（如含少量甲醇的水）洗涤，使待测组分保留着固相柱上，洗去杂质，然后通氮气流干燥固相柱改变洗脱溶剂的极性或pH,使待测成分从固相柱上解吸附，随洗脱液流出，收集洗脱液影响固相提取的因素①合适的洗涤剂和洗脱剂②流速：流速太快会使待测成分与吸附剂不能充分接触,导致与杂质的分离度下降，样品流失，回收率降低或不能重现③上样量：超载易引起回收率差或不稳定,判断是否超载,可进行样品突破性实验。方法为：取已知浓度样品液；小体积上柱，用合适的洗脱方式洗脱；测定百分回收率；增大样品上样体积，重复前面步骤。绘制回收率与样品上样体积曲线，当回收率下降时，表明样品超载固相提取的优点①无乳化现象，待测成分不易损失②溶剂用量少③萃取效能和回收率高④操作安全省时速度快，引入污染少⑤选择合适的溶剂洗涤后，可再生重复使用固相提取的发展趋向：想着操作更简便，易于自动化的方向发展；方法：将提取柱与HPLC/GC系统相连，采用柱切换技术，可以达到自动化的样品处理。样品自动处理系统中，填料多为C18（粒径30-40》m）血清或血浆样品可直接进样，提取柱一般长度为2cm,对脂溶性很强的待测成分可采用更短的柱第五节体内分析方法建立评价一、 样品测定：对照品、对照品加水、空白、空白加对照、样品二、 药物分析方法评价指标：准确度、精密度、检测限和定量限、专属性、药物稳定性、标准曲线、重复性、耐用性、样品测定（QC样品）1.准确度A.回收率⑴提取（萃取/绝对）回收率＞50%能稳定与重现:往空白生物基质或含药物的真实样品中加入的药物标准品已知量A，实际上是准确加入已知浓度的药品标准品溶液一'定体积，使两种考核样品内含总药浓应包括高中低三种，其浓度分别接近公示样品的最高药浓Cmax（标准曲线的上限）、平均药浓和最低药浓Cmin（定量限）每个浓度应测定3-5次，并且测定值M的相对标准差符合以下精密度项下的要求，然后取均值M。内标法中，内标物提取回收率与待测物不相差10%萃取回收率测定方法①对比法：取甲（尖底）乙两支试管，各精密加入等体积的药物标准品溶液（一般为甲醇溶液）然后通空气或氨气挥干，甲作对照，乙中准确加入空白体液一①样品：大黄素制剂②实验动物：狗③给药途径：口服色谱条件的确定：采用HPLC法，确定流动相等成分，荧光法测定。柱温：室温。血浆样品的制备：取得全血后加入抗凝剂后离心取得上清液即血浆，立即冷冻贮存备用。含药血浆测定。不同时间点对含药血浆进行相关测定，绘制时效曲线。使用时采用液液萃取法预处理血浆并进行萃取回收率样品药物回收率的测定。标准曲线的制备：标准浓度应包括一定梯