【报告】纸层析法分离氨基酸实验报告

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纸层析法分别氨基酸一、前言纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分别技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett觉察并使用这一技术证明白植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素移动距离(Rf值)用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。纸层析法(paperchromatography)于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流淌相。3，4-GC、HPLC应用普遍。做叶绿体色素分别时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。ab反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最终在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分别。氨基酸2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，1008002060年月起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用:在食品德业的应用在医药工业的应用在饲料添加剂行业的应用在化装品德业的应用在农业上的应用在其他行业的应用氨基酸工业还有着宽阔的进展前景:传统的氨基酸生产方法运用基因工程手段生产氨基酸大力进展药用中间体,具体为:①氨基酸及其衍生物渐渐成为药用中间体②非自然氨基酸是合成活性药物的重要原料③生产高附加值的非自然氨基酸二、试验目的把握安排层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。三、试验原理纸层析是以滤纸为惰性支持物的安排层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层分别。溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示：Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离Rf值是常数。Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本试验利用纸层析法分别氨基酸。四、试验试剂和器材试验试剂：氨基酸标准液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。2.80%甲酸氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)正丁醇试验器材：华滤纸培育皿电热鼓风枯燥箱吹风机毛细管针、线、尺。钟罩(430mm,290mm，具磨口塞)五、操作步骤标准氨基酸纸上层析单向上行层析Rf值的测定滤纸：选用国产华1号滤纸，6cm×7cm2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子〔留出缝线空间〕。点样：清；中心，这时样品就自动流出；0.5cm样品干后再点其次滴，为使样品加速枯燥，可用吹风机吹干，但要留意温度不行过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果；④将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。留意缝线而造成溶剂前沿不齐，影响Rf1cm剂前沿位置。65℃10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。RfRf3Rf80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml25℃，1h。六、试验结果亮氨酸甘氨酸脯氨酸待测氨基酸原点到层析斑点中6.052.903.492.61心的距离3.746.47原点到溶剂前沿的距离7.247.247.247.24Rf0.840.400.480.360.520.89推断待测氨基酸推断待测氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸理论Rf0.790.300.48七、留意事项点样过程中必需在第一滴样品干后再点其次滴；以免氨基酸破坏，影响定量结果；将揉成圆筒状的滤纸放入培育皿内时，留意滤纸不要碰皿壁；使用的溶剂系统需颖配制，并要摇匀；清；析纸，由于手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污中的氨；展层开放时切勿是样品点浸入溶剂中。八、思考题统？Nernst1891的浓度比为一，即(Kd)。Kd=Ca/CbCaCbA相和B质在A和B何影响?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)RfRf值增大。反之，碱性性溶Rf值增大。什么是安排系数？答：安排系数是指肯定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流淌相中的浓度之比，以K九、争论利用纸层析法分别氨基酸的具体流程及方法，并且了解了其工作原理，这对于以后的学习是有很大帮助的。经查阅资料得，亮氨酸的理论Rf0.79〔酸相〕，脯氨酸的理论Rf0.48〔酸相〕，甘氨酸的理论Rf0.30〔酸相〕。通过比对滤纸上单一氨基酸层析位置、计算出其试验Rf了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸这三种氨基酸。总体来讲，本次试验三种氨基酸试验Rf得出几点影响试验结果的因素，如下：点样过程中未在第一滴样品干后再点其次滴；虽用玻璃罩将滤纸罩住，但还是会有些许空气中的氨在其中，影响试验结果；将揉成圆筒状的滤纸放入培育皿内时，滤纸不留神触遇到皿壁，消灭虹吸现象；使用颖配制的溶剂系统时，并未完全摇匀；析纸，由于手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污并未戴橡皮手套或指套，在制作滤纸筒时手不留神触