Chapter 1绪论 and 2细胞破碎

生物分离工程

主讲：张媛媛MPmail:zyy800928@本课程教材及参考书目孙彦第二版严希康俞俊棠本课程的主要内容1绪论2细胞分离与破碎3初级分离4膜分离5萃取6吸附分离技术和理论7液相色谱8亲和色谱9电泳和电色谱第一章绪论第一节生物技术与生物分离

生物技术（biotechnology)

有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术

生物技术的主要目标：生物物质的高效生产生物加工过程（Bioprocess）？_____生物产物的生产过程生物加工过程上游技术：优良生物物种选育,基因工程，细胞工程和生物反应（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等）下游技术DownstreamProcessing

目标产物的分离纯化（目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化）生物分离的基本概念

从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，称为生物分离，又称下游加工过程。

生物分离（bioseparation)是生物技术的重要组成部分。生物下游加工在生物技术中的地位生物产品的特殊性、复杂性、和严格的质量要求，导致下游加工过程的成本一般占整个生物加工过程成本的大部分。

例如：一般酶：占70％药用酶：高达85％基因工程表达产物：85％-90％以上。

第二节生物物质和生物分离生物物质种类（按分子量大小分类）

小分子（Mass<1000D）：抗生素、有机酸、多肽类、脂类、氨基酸等

生物大分子（Mass>1000D）：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类

超大分子（Mass106-107）：病毒、质粒DNA等

细胞及生物体组织：疫苗、菌苗、胎盘组织液生物物质种类（按发酵时目的产物所在的位置分类）

cell内产物：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质（大肠杆菌表达）、胞内酶

cell外产物：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）、重组蛋白（酵母菌、动物细胞表达）等

常见的生物产品氨基酸、酶类、多肽、蛋白质、核酸、多糖、脂类、有机酸等生物物质的用途

生物药物、功能食品和添加剂、饲料、化妆品、精细生化产品、大宗生化产品、生物能源生物分离工程研究的重点生物产品的特点（1）目标产物稳定性差，易导致生物活性的降低甚至丧失（a

pH

,温度;b酶作用，染菌）（2）生物材料组成复杂，目标产物与其类似物常法难分离（3）原料液中目标产物的浓度一般都很低，杂质含量却很高（4）对目标产物的质量要求高（药品）原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀分级、萃取、膜分离等纯化(色谱、电泳、电色谱)脱盐(凝胶过滤、超滤、离子交换浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性生物分离过程的一般流程：发酵法生产L-异亮氨酸工艺路线

（1）活性：须设计合理的分离过程和操作条件，实现目标产物的快速分离纯化，获得高活性目标产品；

（2）安全性：须除去有害人类健康的物质（如热原及具有免疫原性的异体蛋白等）并防止其从外界混入；

（3）纯度：须优化设计分离过程和各分离操作，采用高效分离纯化技术，以除去难分离杂质（包括目标产物类似物及其异构体）；

（4）浓度：需对原料液进行高度浓缩，以致下游加工过程的成本显著增大。第三节生物分离过程的特点

第四节生物分离技术和原理溶质分离的本质：有效识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质和（或）扩大这些差别的分离设备实现溶质间的分离或目标组分的纯化。物质的性质包括以下几个方面：物理学性质1)力学性质：密度、大小、形状（重力沉降、离心、过滤、膜分离）2)热力学性质：溶解度、挥发度、表面活性、相间分配平衡（萃取、结晶、沉淀、泡沫分离、吸附和离子交换）3）传质性质：粘度、分子扩散和热扩散（应用少）4）电磁性质：荷电性质、电荷分布、等电点、磁性（电泳、电渗析、离子交换、电色谱）化学性质

利用化学反应进行分离（化学吸附和化学吸收）生物学性质（生物分离特有的）生物分子间的分子识别作用、立体选择性（亲和色谱、手性分子的修饰）生物分离技术的分类平衡分离差速分离分离操作平衡分离（扩散分离）差速分离原理：利用外力驱动溶质迁移产生的速度差异传质推动力：有压力差、重力、离心力、电位梯度和磁场梯度等；分离方法：超滤、反渗透、电渗析、电泳、机械分离法（过滤、重力沉降和离心沉降）原理：溶质在两相（气液、气固、液液、液固）间分配平衡的差异传质推动力：溶质偏离平衡态的浓度差方法：萃取、结晶（沉淀）、吸附和离子交换等生物分离操作的策略1)需利用基于不同原理的多步分离操作的串联或组合2)平衡分离技术（萃取、沉淀等）多采用多级分离操作提高分离效率。（差速分离如膜分离亦可）3)需根据目标产物性质和共存杂质的性质选择最佳分离方法（高纯度、高收率、低成本）第五节

生物分离效率分离效率可从两个方面来评价：分离方法和设备分离过程和产品对分离方法和设备的评价指标（针对特定分离方法或设备：离心、膜分离、萃取、色谱）分离容量（capacity)单位体积的分离设备（或分离介质）处理料液或目标产物的体积或质量分离速度(speed)单批次分离所需时间，或连续分离过程的进料速度，批次时间越短，分离速度越快分辨率(resolution)目标产品的纯化效果或杂质的去除能力具体要求：高容量、高速度、高分辨率对分离过程和产品的评价指标浓缩程度分离纯化程度回收率浓缩程度用浓缩率（m）表达，是评价以浓缩为目的的分离过程的最重要指标CTP产品中目标产物的浓度CTC原料中目标产物的浓度X表示杂质T表示目标产物意义：1）如mT>1，则目标产物得到富积；2）如mT=mX，则目标产物未得到分离纯化。分离纯化程度用分离因子（seperationfactor)

表达,又称分离系数。适用于蒸馏、萃取等平衡分离过程适用于连续稳态分离对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离纯化前后目标产物的比活A[U/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度，意义：A、目标产物浓度，杂质浓度，则分离因子大，分离效率；B、=1时，则目标产物未得到分离纯化回收率：目标产物回收的比例连续操作间歇操作生物分离工程研究的根本任务1）分离方法、分离介质和设备2）设计和优化分离过程，提高分离效率，减少分离步骤，缩短分离时间，实现高纯度，高收率，低成本的分离目标第二章细胞分离与破碎一、重力沉降球形粒子的Stokes沉降速度（流体流动处于滞留区）其中：Re为雷诺准数；为阻力系数；d为颗粒粒径；L为液体粘度；s和L分别表示颗粒密度和液体密度。第一节细胞分离（2.6）菌体细胞重力沉降速度符合式（2.6）单一粒子的沉降速度颗粒浓度较大时的沉降速度（2.6）（2.6a）菌体和动植物细胞的重力沉降特点：菌体细胞体积小，沉降速度慢。提高沉降速度的方法：凝聚：加入中性盐（降低菌体表面双电层排斥电位，使菌体凝聚）絮凝：加入高分子絮凝剂：如聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺（使菌体间产生架桥作用，形成较大凝聚颗粒）发酵液预处理的方法（补充）凝聚技术：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象

常用凝聚剂：Al2(SO4)3.18H2O(明矾)，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCO3絮凝技术：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。

常用絮凝剂：

a.聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）b.苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂c.天然有机高分子絮凝剂(明胶、海藻酸钠、甲壳素、右旋糖苷)实验室和工业生产中最广泛应用的非均相分离手段适用于菌体和细胞的回收或除去用于血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分离也广泛用于液液相分离二、离心沉降离心沉降速度其中：r为离心半径；为旋转角速度；N为离心机转数；Zg离心加速度；S为沉降系数，是溶剂物性的函数。离心分离法差速离心分级（Differentialcentrifugation)定义：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离沉降系数差异较大的颗粒。应用：生化工业中常用的离心方法，可用于收集或除去菌体细胞、沉淀的分离关键参数：离心机转数和时间区带离心（Zonalcentrifugation)定义：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖溶液等），样品加于密度梯度之上，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法主要用于分离沉降系数较接近的物质也称为密度梯度离心可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平

根据分离原理，区带离心分为：差速区带离心和平衡区带离心差速区带离心：介质密度梯度中的最大密度小于待分离目标产物的密度，离心操作中，料液中的各个组份在密度梯度中以不同的速度沉降，根据各组份沉降系数的差别，形成各自的区带。密度梯度介质：蔗糖，CsCl（核酸的分离）和NaBr（脂蛋白的分离）等。平衡区带离心（等密度梯度离心）：介质的密度梯度包含待分离样品中所有组分的密度，离心过程中各组分将逐步移至与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带。

差速区带离心与平衡区带离心的区别

1、依据的原理不同差速区带离心依据各组分沉降速率差异被分离；平衡区带离心依据组分本身的密度差异被分离。2、介质的密度梯度范围不同差速区带离心介质的最大密度小于样品中目标产物的密度；平衡区带离心介质密度包含样品各组分的密度。3、时间效应不同差速区带离心不能长时间离心；平衡区带离心长时间离心将各组分停留在等密度位置形成稳定区带。离心分离设备分类据操作是否连续可分为：间歇式、连续式根据形式可分为：立式、卧式根据操作温度可分为：常温离心、冷冻离心机等根据离心力的大小可分为：低速（<8000rpm)、高速（1-2.5万rpm）和超速离心机（2.5万-12万rpm）。

根据适用范围：实验室用离心机（离心管式转子离心机）和工业离心机（管式和碟片式离心机）大容量冷冻离心机台式离心机高速冷冻离心机超速冷冻离心机离心机的种类和适用范围项目低速高速超离转速(×103rpm)2-610-2630-120离心力(×103g)2-78-80100-600适用范围细胞适用适用适用细胞核适用适用适用细胞器－适用适用蛋白质－－适用工业离心设备管式离心机（tubularbowlcentrifuge)碟片式离心机(disc-typebowlcentrifuge)管式离心机（圆筒式离心机）优点：转速可达2万r/min以上，离心力较大.可间歇操作，也可连续操作缺点：沉降面积小，处理能力较低管式离心机的处理能力为：其中：称为离心沉降面积，是离心机结构和操作条件的函数；

L为管长；r2为转筒内径。碟片式离心机(分离板式离心机)特点：结构复杂，离心转速一般较管式离心机低，约1万r/min。碟片的作用是缩短固体颗粒（或液滴）的沉降距离、扩大转鼓的沉降面积，提高处理能力。三、过滤（filtration)定义：利用多孔介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。过滤速度滤液的透过阻力来自两个方面：（1）过滤介质（2）滤饼滤饼阻力是主要因素过滤操作以压力差为透过推动力其中：A为过滤面积；p为操作压力；Q为滤液体积；L为滤液粘度；Rm和Rc分别为介质和滤饼的阻力；滤液的透过速度：滤饼阻力是影响过滤操作的主要因素为滤饼的平均比阻；W为滤饼干重。不可压缩性滤饼：为常数；可压缩性滤饼：＝kpmm为可压缩性滤饼的压缩指数；助滤剂可使m减小滤饼阻力滤饼的特性微生物助滤剂（v/v,%)m面包酵母大肠杆菌0105000.450.340.280.79乳胶粒子00压力

滤饼的平均比阻＝kpm过滤操作中非常敏感和重要的操作参数，特别是可压缩性强（m值大）的滤饼，一般需缓慢增大操作压力，最终压力不超过0.3-0.4MPa减小滤饼阻力的措施

在过滤操作前，须对料液作以下处理：1）絮凝(高分子聚电解质：聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺）或凝聚剂（铝、铁的盐类或石灰等)2）助滤剂（如硅藻土）

目的：改变料液性质、降低滤饼阻力、提高过滤速度工业过滤设备

板框过滤机

加压叶滤机

回转真空过滤机

适用范围广泛应用于培养基制备的过滤及多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。板框过滤机板框过滤机板框组合示意图滤布滤框滤板滤布滤板与滤框之间加滤布，借手动螺杆或液压机构将其压紧，两相邻滤布之间的框间为过滤空间回转真空过滤机水平回转真空过滤机特点：能自动连续操作、节省人力，过滤的适应性好，能处理粘性、具可压缩性滤饼及容易堵塞滤布的物料，但真空度受到热液体或挥发性液体的蒸汽压的限制，推动力小。设备费用较贵。转鼓真空过滤机加压液滤机特点：在密封条件下过滤，适于无菌操作，机体装卸简单，洗涤容易。缺点：造价较高，过滤介质更换复杂。高效密闭管袋式加压过滤机第二节细胞破碎胞外产物：某些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。胞内产物某些微生物在代谢过程中产物在细胞内（胞内酶）或重组DNA产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中真核细胞一、细胞的结构细胞质内含丰富的细胞器结构简单，无细胞核，一般由细胞质和核糖体细胞膜的结构原核和真核细胞细胞膜组成相同，均由脂质和蛋白质构成植物细胞植物细胞和微生物细胞有细胞壁，破碎困难，需用强烈的破碎方法动物细胞动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，易于破碎G+的细胞壁较厚，比G-阴性菌坚固，较难破碎酵母的细胞壁比G+菌的细胞壁厚，更难破碎。不同种类的细胞破碎的难易程度：

植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌＞动物细胞（由难到易）生物产物的胞内位置细胞壁、细胞膜、细胞质、线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细胞器中。破碎细胞的目的：

使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。二、细胞破碎原理机械破碎的原理

细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。化学破碎的原理

又称化学渗透，其原理是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。细胞破碎机理示意图细胞的破碎率：一般用目标产物的释放（溶解）速率价率影响破碎率的因素：破碎方法、细胞种类、目标产物的胞内位置三、细胞破碎技术机械破碎法1）高压匀浆(High-pressurehomogenization)破碎原理：细胞悬液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞受高速撞击后，急剧释放到低压环境，从而在液相剪切力和撞击力等综合作用下破碎。各种形式的高压匀浆器其中：S为细胞破碎率；p为操作压力；N为循环操作次数；k为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。主要影响因素：压力、循环操作次数和温度。高压匀浆器的操作压力一般为：50－70MPa高压匀浆法的特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎。团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用此法。较小的G＋菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。

料液细胞浓度可达到200g/L左右。操作温度上升约２-３℃/10MPa,需要对料液作冷却处理,以保护目标产物的生物活性2）珠磨破碎破碎原理：在搅拌浆的高速搅拌下，微珠高速运动，细胞和微珠（玻璃小珠、石英砂或氧化铝等）之间相互磨擦碰撞而破碎。(固相剪切力和撞击力）主要影响因素：搅拌速度、细胞浓度、微球粒径、密度、填充率和接触时间等。其中：S为细胞破碎率；k为破碎速率常数，与微球粒径、密度、填充率以及细胞浓度、搅拌速度和搅拌桨形状等有关；t在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时t=V/Q(V为破碎室有效体积；Q为细胞悬液的流量）。珠膜的细胞破碎率随细胞种类而异，但均随搅拌速度和悬浮停留时间的增大而增大；对于一定的细胞，存在适宜的微珠粒径，使细胞破碎率最高；细胞悬浮液浓度：60-120g/L(细菌），140-180g/L(酵母）破碎效果较理想。珠磨破碎的特点：适用于绝大多数微生物细胞的破碎，较高压匀浆法适用范围广；有效能量利用率很低(1%)，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多（球粒径、密度、填充率以及细胞浓度、搅拌速度和搅拌桨形状），过程优化设计较复杂。3）喷雾撞击破碎破碎原理：细胞悬液以喷雾状高速冷冻后成为易于破碎的刚性球体，高速撞击固定的撞击板使其破碎。喷雾撞击破碎的特点

细胞破碎均匀，避免过度破碎；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度，避免细胞内部结构破坏，适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收；适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎；可处理的细胞悬浮液浓度为100-200g/L

4）超声波破碎（ultrasonicdisruption)破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。特点：强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎；操作过程产生大量的热，需在冰水或外部冷却的容器中进行。对冷却的要求相当苛刻，不易放大，多在实验室使用。化学和生物化学破碎法

1）酸碱处理调节PH值，改变蛋白质的荷电性质，使蛋白间或蛋白与其它物质间的相互作用力降低，提高目标产物的溶解度

2）化学试剂处理破碎原理：用表面活性剂、螯合剂、盐或有机溶剂、等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者用变性剂（脲或盐酸胍等）降低胞内物质间相互作用，使目的产物易于释放。3）酶溶

原理：利用溶解细胞壁的酶（如溶菌酶、纤维素酶）处理菌体细胞，使细胞壁部分或完全破坏，释放胞内产物。

自溶：通过调节温度、PH值或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶。（利用生物体自身产生的酶来溶胞，无需外加其他酶）。

酶试剂的选择：不同的菌体细胞由于细胞壁化学组成不同应选用不同的酶处理：细菌：溶菌酶；酵母细胞：-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；植物细胞：纤维素酶。酶溶法的特点发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离酶水解价格高，故小规模应用较广机械破碎法与化学破碎法的比较机械破碎法优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。缺点：操作条件较剧烈，易造成细胞的过度破碎，不利于后处理。化学破碎法优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理。缺点：适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。将机械破碎法和化学破碎法结合，可大大提高破碎效率。

物理渗透法1）渗透压冲击法破碎原理：细胞在高渗透压介质（如一定浓度的甘