高效液相色谱法 (续2) 4

11高效液相色谱法

(续2)

例如邻位、间位和对位羟基苯甲酸的Ka1（25℃）分别为1.05×10-3(o-HBA)、8.3×10-5(m-HBA)和2.6×10-5(p-HBA)。它们在水中部分离解，溶液呈弱酸性:

-BondapakC18(4mm×300mm,10m)Ⅰ35%CH3OH+65%H2OⅡ35%CH3OH+0.03%CF3CO2H(pH2.5)

邻位、间位和对位羟基苯甲酸色谱分析问题：1）硅胶柱能否分离？

2）ODS怎样分离？四、离子抑制技术

RCOOHRCOO－＋H＋

如果R基团具有一定的疏水性，当降低流动相的酸度,离解增大,造成保留降低；增大流动相酸度,抑制RCOOH离解,保留时间增大。离子抑制色谱正是调节流动相合适的pH值,使弱酸或弱碱的有机物得到满意的分离。

通常，分离弱酸：pH≤pKa–2;而分离弱碱：pH≥pK+2。但实际上,硅基柱离子抑制色谱通常只用于pKa

≥3的弱酸的分离（为什么？），弱碱的分离只能采用聚合物柱。

未保留溶剂峰

o-m-p-酸抑制：o-m-p-五、离子对色谱

RSO3－＋A＋

RSO3A(RSO3A)SP

tR=to(1＋1/×KIP[Cm-]（1）离子对试剂阳离子样品-己基磺酸钠；阴离子样品-四丁基胺盐。（2）流动相优化流动相系统最好是CH3OH/H2O，缓冲液一般是磷酸盐（pH1.8~3.5和5.8~8.0）和醋酸盐（pH3.7~5.6）。最好保持柱温稳定。用于分离酸的色谱柱最好与分离碱的色谱柱分开。实验后要及时清洗：先6-7倍柱体积水（为什么？），再用5%CH3OH/H2O洗至中性。图IP-HPLC中溶剂优化设计A(CH3OH)B(pH=2.5)C(pH=7.5)D(己烷磺酸盐)阳离子样品分析4．应用举例（1）酸和碱混合物的分离（2）金属螯合物的分离蛋白质分子内疏水基团分布示意图CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3外部亲水内疏水核蛋白质分子具有四级结构的复杂体系，外部有一亲水层，内部有疏水核。蛋白质表面亲水性很强，但也存在一些非极性的疏水基团（苯环等）或疏水区域。生物大分子色谱盐析的原因：盐离子与蛋白质表面具有相反电性的基团形成离子对，部分中和了蛋白质的电中性，使蛋白质分子间的静电排斥作用减弱而聚集起来；由于中性盐的亲水力比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

生物样品中蛋白质的除去可采用硫酸铵沉淀法。

蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。CO2-NH4+NH3+NH3+NH3+SO42+NH4+SO42+蛋白质盐析机理示意图

六、疏水作用色谱

疏水相互作用色谱法（HIC）指采用适度疏水性的固定相,以含盐的水溶液作为流动相分离生物大分子（如蛋白质）键合相色谱方法。

其特点是：采用中性或接近中性的盐水溶液洗脱,样品的生物活性高,成本低等。疏水色谱中无机盐的作用与盐析沉淀蛋白质的作用十分相似。

在HIC中,通常使用大孔径(~100nm)聚合物凝胶上键合一层低密度苯基官能团的有机物为柱填料(如5PW-HIC)的色谱柱,而使用的洗脱剂一般是中性盐缓冲液,

洗脱方式采用降低盐浓度的梯度方式。

HIC分离原理:是基于欲分离的物质表面憎水性残基与固定相表面苯基之间的相互作用。在高离子强度的缓冲液中,这些含大量憎水残基的生物物质很容易与固定相表面的苯基产生非极性相互作用。通过梯度洗脱技术降低洗脱剂的离子强度可减弱这些物质与固定相之间的相互作用,将组分一一分离。图蛋白质在疏水柱和反相柱上的分离比较1细胞色素C2肌红蛋白3溶菌酶TSK5PW硫酸铵从1.7减少到0.1mol/LRP-304乙腈从0增加到100%疏水作用色谱与反相色谱的比较★（固定相的差别）HIC填料表面疏水性没有RPC强：疏水基团一般是低密度的苯基、戊基、丁基、丙基等★（流动相的差别）

HIC一般采用pH6-8的盐水溶液[如(NH4)2SO4]，作降浓度洗脱。在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来★（应用特点）HIC分离条件有利于蛋白质保持活性，回收率高离子性化合物如何分离？●光度检测的可行性

卤素、无机酸根和一些弱的有机酸根离子，在可见或紫外区域没有光吸收或吸收很弱。所以用一般的紫外、可见及示差折光检测器进行检测时，很难获得满意的结果。●抑制或离子对色谱●离子交换色谱(IEC)离子化合物如何检测？●电导检测的可行性：

电导是离子的通用性质，但洗脱液的电导如何消除？通常离子交换色谱采用较高浓度的酸/碱/盐为淋洗液，淋洗液本身具有较高的电导（淋洗液的电导，通常称为“本底电导”或“基体电导”）。待测离子的电导变化往往会被淋洗液的本底电导所掩盖（为什么？），难以采用电导检测器进行检测。11.7离子色谱(IonChromatography)

离子交换色谱（IEC）是最先得到应用的液相色谱分析方法。目前，离子交换色谱不如其它HPLC模式应用广泛，许多离子混合物分析应用被离子对色谱和离子色谱所代替。

氨基酸的分离：采用强酸型阳离子交换树脂，不同的酸度和离子强度分段洗脱。①氨基酸分析仪②柱后衍生检测（如茚三酮）●糖类的分离：糖化合物与硼酸生成络阴离子,用阴离子交换树脂进行分离。

离子色谱的由来：早期的IEC，缺少相匹配的检测器，难于发挥更大的作用。如无机离子与大多数有机离子不同，只有在远紫外区才有吸收，光度检测器不适合于检测无机离子；但在IEC中,通常采用强电解质作洗脱液,流动相的本底电导淹没了样品离子的电导,使得人们无法采用通用的电导检测器进行检测。

离子色谱是一种分析离子化合物的液相色谱,它是在离子交换色谱的基础上发展起来的。1975年Small发明了采用电导检测器检测离子交换色谱流出液的方法。为有别于以往的离子交换色谱法，他把这一方法称为“离子色谱”。为什么需要抑制背景电导？X-/NaHCO3-Na2CO3

500t/minFCl5001放大检测信号，背景信号同时增大，并不能改善检测限分离柱抑制柱一、离子色谱法的基本原理淋洗液槽泵进样阀分离柱电导检测抑制柱记录仪输送分离检测数据处理图离子色谱仪流程图图淋洗液抑制反应对离子检测的影响离子交换柱●分离过程：当淋洗液将样品离子X-带到阴离子交换分离柱时，由于各种离子对离子交换树脂的亲合力不同，样品在分离柱上分离成不连续的谱带，并依次被淋洗液洗脱下来并与淋洗液一起流出分离柱。交换：R+-OH-+Na+X-→R+-X-+Na+OH-洗脱：R+-X-+Na+OH-→R+-OH-+Na+X-

离子色谱基本原理高效离子交换色谱分离电导抑制器（最常见检测方式）1）分析柱的选择？2）出峰顺序？如卤素阴离子？3）如何获得高柱效？思考题：●抑制过程：当分离后的样品离子与淋洗液一起进入抑制柱时，由于抑制柱中填充有阳离子交换树脂，淋洗液与分析样品就发生了如下的反应：

Na+OH-+R--H+→R--Na++H2ONa+X-+R--H+→R--Na++H+X-

由此可见淋洗液中Na+置换出H+，把OH-中和成水，消除了原来淋洗液的高电导，有利于电导检测器进行检测；同时待测离子与氢离子形成强酸离子对，在阳离子中由于氢离子的极限摩尔电导最大，这样就有利于阴离子的分析。注意：电导检测器是一种通用性检测器，它检测的溶液中阴离子和阳离子的电导总和。思考题：1）抑制柱的选择？2）如何获得大容量抑制柱？3）试分析NaHCO3-Na2CO3洗脱液的抑制过程。

离子色谱→电导检测→抑制原理离子色谱法解决了阴离子型化合物长期以来缺乏快速灵敏分析方法问题。目前它是阴离子分离分析的首选方法（无机阴离子分析的“ICP”方法）。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。环境分析水质分析

AB图用填充树脂抑制柱时电导检测器检测的变化

1.F-

，2.Cl-

，3.NO2-

，4.H2PO32-

，5.Br-

，6.NO3-

，7.SO42-用新再生的填充树脂抑制柱时获得的色谱图用耗用了一半的填充树脂抑制柱时获得的色谱图(A)(B)二、离子色谱抑制器化学抑制

抑制器是离子色谱仪电导检测的一个核心部件，抑制能力和使用的方便性是其主要性能指标。●树脂填充式抑制柱●纤维管抑制柱●平板微膜抑制柱●电化学抑制器（重点）

抑制容量：单位时间内抑制柱可抑制的淋洗离子的摩尔数。1）树脂填充式抑制柱阴离子分析：分离柱采用低容量强碱型阴离子交换柱,常用NaHCO3和Na2CO3混合液作流动相；串联在分析柱后面的抑制柱则采用高容量的强酸型阳离子交换柱。

树脂填充式抑制柱缺点：

A.抑制柱需定期再生。（如何再生？）

B.弱酸阴离子和弱碱阳离子在抑制柱中的行为复杂。阳离子分析：分离柱为低交换容量强酸型阳离子交换树脂,而抑制柱是交换容量大的强碱型阴离子交换树脂,洗脱液中高电导的H＋被抑制柱反应生成低电导的水,最后检测的是流出液中的M＋和OH－的电导。

2）纤维管抑制柱

采用磺化的聚乙烯阳离子交换空心纤维管为抑制柱。在纤维管外表面通过与淋洗液（NaHCO3）逆向而行的再生液（H2SO4）。当淋洗液（NaHCO3）通过纤维管时，阳离子Na+被库仑力吸引到管壁的离子—SO3-基上，同时再生液（H2SO4）中的质子也被吸引，并通过下述反应不断消耗H+，使H+透过膜的扩散不断进行以下反应：CO32-+H+→H2CO3优点：实现抑制柱的在线再生，克服了填充式定期再生的问题。缺点：离子交换速度慢；纤维管的加工工艺复杂，管内有时会产生气泡，干扰测量，还需推动再生液的装置；受淋洗液强度限制，不能进行梯度洗脱。

图纤维管抑制柱CO32-+H+→H2CO3H2SO4NaHCO3+X-H+Na+阳离子交换膜3）平板微膜抑制柱85年,Dionex公司★在流出液通道填充细目交换剂，提高了离子交换速度，从而提高了抑制柱的交换容量★抑制柱的死体积小检测器分离柱4）电化学抑制器85年，田昭武、胡荣宗等研制成功XYZ-1型电化学抑制柱。92年，Dionex公司推出SRS系列电化学抑制柱。海水淡化----电渗析原理+-盐水淡水极水1离子在电场下的定向迁移2膜的选择性透过3分离对象/产品的去向关注电化学抑制器的工作原理图电化学膜抑制器的抑制原理(阴离子分析)对比电渗析●膜类型及位置●离子的迁移●作用及目的思考题：试设计用于阳离子分析的电化学抑制器。电化学抑制器阳极室的H+穿过阳离子膜进入中间的抑制室：

HCO3-+H+→H2CO3流出液中Na+的穿过阳离子膜进入阴极室流出液中的样品离子Cl-的电迁移受到阳离子膜的阻断Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3+-H+

Na+

Cl-

H2SO4

+-盐水淡水+-Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3抑制器与电渗析对比原理相同目的不同阳极室膜的种类不同电化学抑制的特点●与化学抑制柱不同，电化学抑制器是以电场力作为离子迁移的动力，提高了抑制速度，从而提高了抑制柱的抑制容量和缩短了抑制时的平衡时间。●使电导检测的梯度淋洗成为了可能。图电再生固相抑制柱(ERIS)的抑制和再生示意图图离子逆流原理近几年来，Alltech

公司提出了一种电再生固相抑制柱(ERIS)以实现再生液的自再生和抑制柱的连续工作；Small提出了“离子逆流”原理，在一根抑制柱上实现了将淋洗液的产生、阴离子的分离和淋洗液的抑制都集中在一根抑制柱中自动完成。（结合查考文献自学！）三、非抑制离子色谱“单柱法”

单柱离子色谱法的基本原理是以低容量的离子交换色谱柱分离，采用低电导低浓度的洗脱液，由于降低了洗出液本底电导水平，这样可采用电导检测器检测样品离子的电导。单柱法通常可在普通色谱仪上进行。阴离子分析可用低浓度（1×10-4-1×10-5mol/L）的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐作为洗脱剂；阳离子分析则采用1-2mol/L的HNO3或乙二胺盐作为洗脱剂。

在使用上，双柱法具有较高的灵敏度，但死体积较大；而单柱法死体积较小，比双柱法使用更低浓度的洗脱剂以及更低交换容量的填料，但由于其柱容量小，因此，进样量受到一定的限制。

单柱法的检测：电导法和间接光度法

间接光度法是一种离子对探针检测无紫外响应物质的技术。在离子色谱中，如果流动相含有吸收紫外光性能的洗脱离子，那么可以采用紫外检测器间接检测无紫外吸收的样品离子。四、间接光度色谱法

(Indirectphotometricchromatography)方法原理：在阴离子分离中，假设以具有吸收紫外光性能的洗脱掖Na+E-溶液来洗脱无吸收的样品液Na+S-

，可以通过检测E-的变化来间接测定S-。因为基于交换平衡原理和电中性原理，在流出液中，当S-离子出现时，洗脱剂中的E-离子必然有一协调的、等当量的改变（Na+的浓度确定，S-增大，E-则减少），这样连续监测洗脱离子E-的浓度变化，从而反应出S-离子在柱中被分离的情况。间接光度法出现负峰色谱图，可将信号转化为“正峰”处理。可见在间接光度色谱法中，洗脱剂的吸收光离子具有双重作用：

l

从色谱分离柱中选择性地洗脱样品离子

l

在流出液中充当样品离子的探针

此外，对于无吸收的样品离子间接光度法的色谱峰面积只与样品离子的浓度有关，而与样品的种类无关，同时灵敏度随所用洗脱剂的浓度的降低而增大。

除了传统的以抑制柱为特点的离子交换色谱（HPIC）外，离子色谱技术还出现了以Donnan排斥、空间排阻和吸附过程为分离机理的离子排斥色谱（HPIEC）和以吸附为分离机理的离子对色谱（MPIC）。五、离子排斥色谱

(IonExclusionChromatography，IEC)

高容量阳离子交换树脂使样品阴离子由于受到Donnan排斥很快流出色谱柱,而低电离度弱酸分子能进入到树脂内部，且通过溶质与树脂功能团之间的极性相互作用和溶质与树脂基体间的非极性相互作用为固定相保留。因此，在离子排斥色谱中溶质的保留作用取决于：

l

溶质受阻程度的不同

l

溶质与树脂功能团间极性相互作用的差别

l

溶质与树脂功能团间非极性相互作用的差别

离子排斥色谱主要用于有机酸无机弱酸和醇类的分离。如用离子排斥色谱柱,稀盐酸为流动相,可分析30余种常见的水可溶性有机酸,其中包括用气相色谱难于分析的羟基有机酸。

强酸中弱有机酸的测定，用阴离子交换分离是非常困难的。例如2.5g/L硫酸中1.0mg/L脂肪酸等弱酸（为什么？）。

但用IEC，硫酸根不被保留，不干扰弱酸（柠檬酸、羟基丁二酸、乙醇酸、乙酸、丁二酸）的定量。11.8体积排阻色谱

(SizeExclusionChromatography,SEC)

体积排阻色谱,也称为凝胶色谱,包括:¶凝胶过滤色谱(GFC):,以水为流动相¶凝胶渗透色谱(GPC):以有机溶剂为流动相。

在许多色谱模式探索中,人们往往从溶质——固定相——流动相之间的相互作用力来讨论色谱分离问题。流动相溶剂的选择非常重要。

对于排阻色谱，这一思路是否可行？排阻色谱分离机理:(注意与其它液相色谱的不同点）一般液相色谱是根据样品组分在固定相和流动相之间的平衡分配系数不同，造成不同的移动速度而达到分离。而排阻色谱是根据溶质分子尺寸(分子量、有效体积、流体力学体积)的差别进行分离的。它主要应用于高分子化合物和聚合物的分子量分布测定,在生物化学和材料科学领域中得到广泛的应用。1．排阻色谱分离过程

排阻色谱的分离过程是在装有多孔物质(交联聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅胶等)为填料的柱中进行的,填料的孔径在制备时已严格加以控制。.溶质在填料中的渗透体积不同样品分子通过多孔填料的排阻机理示意图

如果某样品分子太大不能进入填料的孔中,就会被填料所排阻。这些大的样品分子直接流过柱子,并首先在色谱图上出现。一些小到几乎可渗透到整个填料颗粒的样品分子具有最大保留值,通过柱子最慢,并最后在色谱图上出现。而中等体积的样品分子靠近孔壁的可能较小,平均来说,这些分子在孔中停留的时间较短,它们通过柱子的速度取决于它们的相对大小。色谱柱体积：

Vc=VM+VS+V式中V为填料体积，VS为填料微孔隙总体积,VM为柱空隙体积（颗粒间隙体积）。组分的洗脱体积：

Ve=VM＋KdVS

式中Kd为排阻色谱的分配系数,它表示组分分子可以扩散进入的内孔体积(即对某种尺寸的溶质分子来说可以渗透进去的那部分孔体积)与内孔总体积之比。

排阻色谱中样品分子的大小是指它在流动相中的有效体积,即它在流动相中的转动半径,这与分子的几何形态(球形、棒形或无规则卷曲形)和溶剂化作用有关。¶Kd=0,Ve=VM

样品分子被完全排阻；¶Kd=1,Ve=VM＋VS

样品分子完全渗透（自由扩散）；¶0<Kd<1,VM<Ve<VM＋VS

样品分子选择性渗透,样品组分按它们的分子大小被分离。出峰顺序为从大到小,均在溶剂峰之前流出柱子。思考：1）排阻色谱的出峰顺序？

2）洗脱溶剂对分离是否有影响？

在排阻色谱中，选择性仅与分子大小的差异有关。要改进分离度只能靠凝胶的孔径大小和孔径分布的最佳化来实现。由悬浮聚合产生的均匀球型微粒能提供高的柱效率。与其它色谱的最大的区别为洗脱出的组分峰宽相等。排阻色谱(SEC)—色谱柱校正曲线Eluent:THF（2）分离模型（自学）：所谓的分离机理就是根据一定的物理模型,用分子参数和柱结构参数来计算Ve和K。目前有三种分离理论：①平衡理论：认定分子扩散进入填料颗粒的孔中并再出来所需的时间远小于溶质区段在此停留的时间,溶质分子出入孔达到了平衡。在其它形式的液相色谱中，溶质在流动相和固定相之间进行分配。不管是吸附或分配都涉及到两相之间的移动，伴随着分子间和实际存在的热焓变化，而熵在这种色谱分离过程中的变化十分小，常常忽略不计。由于ΔH一般为负值，因此K值大于1，即溶剂峰先于溶质峰流出。在体积排阻色谱中主要是熵的变化，ΔH≈0，所以

排阻色谱运行时，溶质在填料微孔中的流动有一定的限制，因此，溶质的渗透伴随着熵的降低。由于溶质峰是先于溶剂峰洗脱，Kd值自然小于1，而且是一个不受温度影响的参数。ΔS对一切溶质均为负值，同时在分离过程中可以控制。②限制扩散理论：认为分离是由不同尺寸的聚合物分子在往孔中扩散时其扩散速度的不同决定的。③流动分离理论：速度的流型分布决定分离。（3）聚合物在体积排