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文档简介
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量【目的要求】学习SDS测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。【实验原理】电泳带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下,分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。PAGE
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,
N’-甲叉双丙烯酰胺
CH2=CH
C=O
NH
CH2
NHC=O
CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH
C=ONHCH2NHC=O
CH2-CHCH2¯
CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m
PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变
Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。SDS
是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。【SDS基本原理】
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS
复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。将已知分子量的标准蛋白质在SDS
中的电泳迁移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率,就能根据标准曲线求得其分子量。当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时,蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系:
lgMW=K-bm
【操作方法】1、制胶玻板的清洗
用海绵和洗涤剂轻柔地清洗,严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉,完全冲洗干净后烘干。【操作方法】2、垂直板电泳槽
1)分离胶的制备配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液(1.5mol/LTris-HCl,pH8.8)2.5ml,10%SDS0.1ml,凝胶储备液4.0ml,10%过硫酸铵50ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合,所以应立即混匀混合液,用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内,留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶,小心覆盖一层蒸馏水,37℃烘箱下聚合(约30min)。待分离胶聚合完全后,除去覆盖的蒸馏水。
3、凝胶的制备
2)浓缩胶的制备配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl,pH6.8)1.25ml,10%SDS0.05ml,凝胶储备液0.8ml,10%过硫酸铵25ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合,所以应立即混匀混合液,用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内,灌满后小心插入梳齿,避免混入气泡,37℃烘箱下聚合(约30min)。4、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B
MW=97,400
牛血清白蛋白MW=66,200
牛碳酸酐酶MW=31,000
胰蛋白酶抑制剂MW=20,100
鸡蛋清溶菌酶MW=14,400
开封后,沸水浴中加热3-5min后上样。
2)样液的准备
用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中,再加入50ul上样缓冲液,混匀后沸水浴中加热3min,取出冷却后加样。
将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接,打开电泳仪开关,设置电压为200V,电泳60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部,停止电泳,关闭电源。6、电泳5、加样
用移液器分别取5l样品液,小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。8、结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm)溴酚蓝区带距加样端距离(cm)7、染色与脱色
电泳结束后,取下玻板,在自来水下用特制板撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色60mins,再用脱色液脱色,直至蛋白质区
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