第二章中药化学成分的一般研究方法

第二章中药化学成分的一般研究方法教学内容Δ2.1中药化学成分的主要类型。Δ2.2

中药化学成分提取分离方法的基本原理及应用。2.3中药化学成分结构鉴定的一般程序和方法。2.1

中药化学成分的主要类型

（一）从物质基本类型分：有机物、无机物。（二）按元素组成、结构母核分：生物碱、黄酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等。（三）按酸碱性分：酸性、碱性、中性。（四）按溶解性分：非极性（亲脂性）、中极性、极性（亲水性）第二章中药化学成分的一般研究方法（五）按活性分：有效成分、无效成分具有生物活性，能用分子式和结构式表示，并具有一定的物理常数的单体化合物，称为有效成分。与有效成分共存的无生物活性的成分称为无效成分。（六）按生产合成途径分：一级代谢产物（如糖、蛋白质）、二级代谢产物（如生物碱、黄酮、皂苷）。第二章中药化学成分的一般研究方法2.2中药化学成分提取分离方法的基本原理及应用一、基本概念1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。二、提取方法水

溶剂提取法：溶剂

亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂水蒸气蒸馏法超临界流体萃取法（SFE）

升华法压榨法

（一）溶剂提取法1、原理

根据中药中各种成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从药材组织中溶解出来的一种提取方法。选择溶剂依据相似相溶原理。2、选择溶剂的要点*对所要成分溶解度大*沸点适中容易回收*低毒安全中药化学成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。最常用的溶剂为乙醇。3、溶剂的分类*强极性溶剂：水*亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*亲脂性有机溶剂：不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）常用溶剂的极性大小顺序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水4、化合物的结构与亲水性、亲脂性的关系（1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强，反之则亲脂性越强。（2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。（3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强，亲脂性越弱。5、溶剂的选择

(1)水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。(2)亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。(3)

亲脂性有机溶剂：具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。6、溶剂提取的方法浸渍法渗漉法溶剂提取的方法煎煮法回流提取法连续回流提取法超声法（1）浸渍法：以水或稀醇反复提取，适于遇热易破坏或挥发性成分及含淀粉、粘液质较多的中药。（2）渗漉法：以稀乙醇或酸水作溶剂，先浸后渗，提取效率高于浸渍法。

（3）煎煮法：以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的中药也不适用。（4）回流提取：用有机溶剂。对遇热易破坏的成分有影响。（5）连续回流提取：用有机溶剂。提取效率高，节省溶剂。（6）超声法7、影响溶剂提取法的因素合适的溶剂和方法、药材的粉碎度、提取温度及时间。（二）水蒸气蒸馏法适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分的提取。挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。（三）超临界流体萃取法最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。（四）升华法（五）压榨法三、分离精制方法（一）溶剂法

1、酸碱溶剂法

（1）酸溶：有机碱性成分可与无机酸成盐而溶于水。（2）碱溶：具有羧基，用碳酸氢钠；具有酚羟基，用氢氧化钠；具有内酯或内酰胺结构的成分可被皂化而溶于水。

使用注意：酸碱的强度、加热温度、与被分离成分接触的时间等。

总提物乙酸乙酯液

酸水提取酸水层有机溶剂层调pH12NaHCO3

有机溶剂萃取

有机层水层水层有机层（碱性成分）（强极性酸化NaOH

中性物质）有机溶剂提取萃取有机层有机层水层（有机酸）（中性）酸化有机溶剂萃取有机层（酚）2、溶剂分配法原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。一般采用全量多次分配提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。

溶剂的选择：对于分离极性较大的成分，用正丁醇-水；分离中等极性成分，用乙酸乙酯-水；分离低极性成分，用氯仿（或乙醚、石油醚等）-水。所用装置：分液漏斗、连续液-液萃取装置、液滴逆流层析装置。（1）系统溶剂萃取法：常用来粗分，是将总提物分散于水中，依次用石油醚（或环己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂得到相应极性的成分。极性成分类型适宜溶剂强亲脂性挥发油、脂肪油、苷元石油醚脂溶性色素、甾醇己烷亲脂性苷元、生物碱、树脂乙醚

醛、醇、酯、有机酸氯仿小强心苷氯仿-乙醇（2：1）中极性中黄酮苷乙酸乙酯大皂苷、蒽醌苷正丁醇亲水性极性很大的苷、糖类丙酮

氨基酸、某些生物碱盐甲醇、乙醇强亲水性蛋白质、粘液质、氨基酸水果胶、糖类、、无机盐类（2）逆流连续萃取法

利用两相溶剂比重不同可自然分层和分散液滴穿过连续相溶剂时发生传质的原理，用一根或数根萃取管制成逆流连续萃取装置。管内的瓷环，增加液滴上升的路程和在连续相中停留的时间，更重要的是上升的液滴因撞击填充物而被分散，扩大了两相溶剂萃取的接触面积，使更萃取完全。优点：克服了分液漏斗多次萃取和易乳化的麻烦。（3）逆流分布法（CCD）

对性质相似的异构体或同系物分离效果好。基本原理仍是利用混合物中成分在两种不相混溶的溶剂中分配系数的不同，经过在两相溶剂中多次转移，而使它们达到分离的目的。（4）液滴逆流层析法（DCCC）

是在逆流分布法基础上发展的高分离效能的逆流分布法，分离管有100~1000根，互相串联，上行法时，分离管内充满重相作为固定液相，利用泵将轻相（移动相）带着样品液进入分离管，形成液滴通过分离管，流出的移动相通过检测，分部收集。*溶剂分配法中溶剂系统的选择：

两相溶剂不相混溶，混合物中各单一成分在溶剂系统中的分配系数差别越大越好。分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好的溶剂。*操作注意：（1）先将两相溶剂相互充分饱和。（2）采用等体积两相溶剂的方式。（3）欲分离混合物的浓度不宜过高。（二）沉淀法1、酸碱沉淀法：例如：生物碱、黄酮、蒽醌2、专属试剂沉淀法：例如：雷氏铵盐沉淀季铵碱、胆甾醇沉淀甾体皂苷；明胶沉淀鞣质。3、分级沉淀法：改变加入溶剂的极性或数量使沉淀逐步析出的方法。例如：多糖、蛋白质的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，则可得到分子量由大到小的多糖、蛋白质；皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按极性从小到大逐步沉淀。4、铅盐沉淀法

中性醋酸铅：与酸性或酚性物质沉淀碱性醋酸铅：除以上物质外，还可沉淀具有醇羟基、酮基、醛基结构的物质。脱铅：通入硫化氢法；中性硫酸盐法；阳离子交换法。5、盐析法

在混合物的水溶液中，加入无机盐（常用的是NaCL，其它还有Na2S、MgSO4、NH4SO4）至一定浓度或达到饱和，使某些成分沉淀析出或用有机溶剂萃取出而达到分离的目的。（三）分馏法

利用混合组分中各成分的沸点不同而分离的一种方法。用于液体混合物的分离。（四）膜分离法利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜分离技术。原理是大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到分离。关键是选择适宜的膜。（五）结晶法1、结晶的条件（1）溶剂：选择合适的溶剂对结晶的形成是关键。合适的溶剂应对欲分离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热溶解度一致；沸点要适中；不与被分离成分产生化学反应。选择溶剂依据“相似相溶”原理。（2）温度通常在加温的情况下，溶解过滤，除杂，浓缩，放冷。最合适的结晶温度5~10度。（3）时间一般3~5天或更长时间。（4）浓度一般是多一些溶剂，放置使其慢慢挥发到合适的浓度。（5）杂质（6）有效成分的含量越高，越易结晶。2、结晶溶剂的选择对所需成分的溶解度随温度不同而有显著差别，同时不发生化学反应；查阅相关文件，参考“相似相溶”规律；选择混合溶剂，低沸点溶剂对物质溶解度大，高沸点溶剂对物质的溶解度小；常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等。（六）色谱分离法1、吸附色谱利用同一吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离目的的色谱方法。吸附能力的强弱是由吸附剂和被吸附物质的性质决定的。吸附色谱法的分离效果，完全由吸附剂，溶剂和被分离物质的性质决定。（1）常用吸附剂：*硅胶：多孔，微酸性，其吸附能力稍弱于氧化铝。吸附作用是由于颗粒表面有很多硅醇基，它可以和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，所以硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。硅醇基还易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱。吸水量超过12%就不能做为吸附剂了。

当加热到了100-110℃时即可除去绝大多数硅醇基吸附的水分，恢复吸附活力，这一过程称为活化。当温度上升到500℃时，硅胶表面的硅醇基则脱水缩合转变为硅氧环结构，从而丧失吸附活性。硅胶适于分离的化合物范围很广泛，但不宜分离碱性化合物。*氧化铝由氢氧化铝直接在高温下脱水制得，带微碱性，适于分离碱性成分。*聚酰胺适于分离黄酮、酚、醌类、有机酸及鞣质，可使性质极相近的化合物得到分离。原理：聚酰胺中的酰胺基可与酚羟基、羧基、羰基、硝基等形成氢键吸附。聚酰胺的吸附容量大。被分离成分的结构与吸附力的关系：1）可形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强，越难被洗脱。2）形成分子内氢键的吸附能力会减弱。3）分子中芳香化程度越高，吸附能力越强。

。

4）对聚酰胺柱的洗脱能力，与溶剂的种类有关：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次减弱。（2）溶剂对于极性吸附剂，溶剂极性越大，洗脱能力越强。对于非极性吸附剂，则相反。（3）被分离物质对于极性吸附剂，被分离物质的极性越强，吸附力越大，越难洗脱。（4）操作方式1）薄层色谱：制板点样展开显色2）柱色谱：装柱上样洗脱收集浓缩检识合并结晶（二）分配色谱1、基本原理利用物质在固定相和流动相之间分配系数不同而达到分离。2、分类正相色谱：固定相极性>流动相极性，用于分离极性和中等极性的成分。反相色谱：固定相极性<流动相极性，用于分离非极性和中等极性的成分3、洗脱规律：

正相色谱中，极性小的化合物先被洗脱，极性大的化合物后被洗脱；反相色谱正好相反。4、常用的固定相和流动相固定相：正相色谱中常用氰基或氨基键合相；反相色谱中常用C18或C8键合相。流动相：正相色谱中主要用有机溶剂；反相色谱中常用甲醇-水或乙腈-水系统。（三）离子交换色谱法1、基本原理基于各成分解离度的不同而分离。2、离子交换剂的种类离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶。3、应用主要用于生物碱、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等水溶性成分的分离纯化。4、操作要点装柱前要用水充分溶胀，并用酸、碱预处理。（四）大孔吸附树脂法1、性能及分离原理（1）

性能：大孔树脂是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。一般为白色颗粒，20~60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。水溶液中吸附力较强，且有很好的选择性。（2）原理既有吸附性，又有分子筛的筛选性。吸附性是范德华引力或氢键吸附的结果；筛选性则由其多孔性网状结构引起的。2、影响分离的因素（1）

分子极性的大小极性较大的化合物适宜于在中极性的树脂上分离，而极性较小的化合物则适于在非极性树脂上分离。对于中极性树脂来说，被分离化合物分子上能形成氢键的基团越多，吸附力越强。（2）分子体积的影响对于非极性大孔吸附树脂而言，化合物体积越大，吸附力越强，这与大体积分子疏水性强有关。

（3）PH

一般酸性化合物在适当酸性溶液中可被充分吸附，碱性化合物则在碱性条件下易被吸附，中性化合物在中性情况下吸附较好。3、树脂柱的清冼和再生

用乙醇、丙酮、异丙醇、2~5%盐酸、2~5%氢氧化钠渗漉法洗脱或回流。4、洗脱顺序

一般被分离物质极性越小，越先被洗脱下来，极性越大，越后洗脱下来。5、应用（1）成分的类型与树脂的选择：（2）优点：吸附容量大，选择性好，成本低，收率较高，再生容易等优点。

成分类型大孔树脂类型

树脂型号举例脂溶性成分（甾、萜、黄酮、苯丙素、生物碱）非极性或弱极性树脂D-101,AB-8,HPD-100皂苷、生物碱苷弱极性或极性D-201,D-301,HPD-300,AB-8,NKA-9黄酮苷、蒽醌苷、苯丙素苷弱极性或极性树脂D-201,D-301,HPD-600,AB-8,NKA-9环烯醚萜苷极性树脂D-301,HPD-600,NKA-9（五）凝胶色谱法1、性能及分类葡聚糖凝胶是葡聚糖和甘油，通过醚桥键相交而成的多孔网状结构物质。交链度越大，网状结构越紧密，网孔越小，吸水膨胀就越大，可用于小分子量物质的分离。反之，则用于大分子量物质的分离。常用的有葡聚糖凝胶（SephadexG）、羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）、聚丙烯酰胺凝胶（Sephacrylose,商品名Bio-gelP）及琼脂糖凝胶（Sepharose,商品名Bio-GelA）等。2、分离原理

葡聚糖凝胶吸水后，形成凝胶粒子，在交链键的骨架中存在着许多网眼，只能使小分子量的化合物进入，大分子量的化合物被排阻在凝胶颗粒的外部难以进入网眼内部，因此大分子物质首先被洗出。3、应用

主要用于分离水溶性大分子化合物。（六）高效液相色谱（七）气相色谱(八）超临界流体萃取

是集提取和分离于一体，又基本上不用有机溶剂的新技术。当一种物质处于临界温度与临界压力以上的状态下，形成即非液体又非气体的单一相态，称超临界流体（SCF）。

利用一种物质在超临界区域形成的流体进行提取的方法称SCFE。SCF与常温常压下的气体和液体比较，其密度接近液体，而粘度又接近气体，扩散系数比液体大100倍，浸透性优于液体。

物质的溶解过程包括分子间的相互作用和扩散作用。所以物质的溶解度与溶剂的密度、扩散系数成正比与粘度成反比，因此超临界流体对许多物质有很强的溶解能力。

SCF做流动相时，兼具气层和液层的特点，可以分离气相不能适用的不挥发性的较大分子，又能分离挥发油，其分离速度比液相可以快5~10倍，分辨能力大5倍。常用的超临界流体为CO2,它的临界温度为31.4℃，临界压力为7.37Mpa,易操作，价格便宜，无毒。可以通过改变压力而改变超临界流体的特性，因为在一定温度条件下，改变压力即可改变流体的密度和极性，利用程序升压即可将不同极性成分进行分步提取。

CO2

在高于临界温度和压力的条件下，溶解出中药原料中的成分，当恢复常压时，溶解在CO2超临界流体中的成分便与气体CO2自动分离。

二氧化碳超临界流体对物质溶解作用有一定选择性，极性较低的化合物，如酯、醚、内酯和含氧化合物易被萃取；极性化合物，如带羟基、羧基的难于萃取。也可以在流动相中加入夹带剂以改变其性能。对溶质具有较好溶解性的溶剂也往往是很好的夹带剂，常用甲、乙醇、丙酮，夹带剂的