第二章 基因工程制药

第二章基因工程制药2.1

概述1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励科学家利用基因工程技术研制新产品。迄今，30余种基因工程药物投入市场，产生巨大经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为现实。2.1.1利用基因工程技术生产内源生理活性物质糖尿病：胰岛素侏儒症：人生长激素其它内源性生理活性物质：激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等来源困难技术尚未解决造价高

利用基因工程技术获得上述活性物质成为可能2.1.2

基因工程药物种类免疫球蛋白：抗原和单克隆抗体细胞因子：干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子激素：胰岛素、生长激素、心钠素酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶2.1.3

利用基因工程生产药品优点可大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽，为临床使用提供有效的保证可提供足够数量的生理活性物质，便于对其生理、生化和结构进行深入研究，扩大这些物质的应用范围可生产更多的内源性生理活性物质对内源性生理活性物质使用中出现的问题可以通过基因工程进行改造可获得新型化合物，扩大药物筛选范围2.1.4我国基因工程药物研发现状1997年生产得到α1b干扰素上游技术落后3－5年下游技术（工程菌大规模发酵技术、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等）落后15年2.2基因工程药物生产过程上游技术：目的基因分离、工程菌（细胞）构建 在实验室完成下游阶段：工程菌（细胞）大规模培养直到产品分离纯化和质量控制等。2.3目的基因获得反转录法反转录-PCR法化学合成法筛选新基因方法：编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术等对已发现基因改造基因修饰技术定点突变技术目的：提高基因表达产物的稳定性，提高体内半衰期、提高表达产物生物学活性、降低有效使用剂量或提高表达量、降低毒性和免疫原性2.4基因表达目的基因表达产量表达产物稳定性产物生物学活性表达产物分离纯化2.4.1宿主应满足条件具有高浓度、高产量、高产率能利用廉价原料不致病、不产生内毒素发热量低，需氧低，适当温度和细胞形态容易进行代谢调控容易进行重组DNA技术产物容易提取纯化2.4.2宿主分类原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌真核细胞：酵母、丝状真菌大肠杆菌优点：研究较为深入缺点：不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需将细胞破碎，造成提取困难分泌能力不足，真核蛋白常形成包涵体，表达产物须经变性复性才能恢复其生物学活性不存在翻译后修饰，只能适用于表达糖基化等枯草芽孢杆菌优点：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中不形成包涵体缺点：不能对蛋白质进行糖基化修饰会产生很强的胞外蛋白酶，可对产物进行不同程度的降解链霉菌优点：非致病，使用安全分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中具有糖基化修饰能力变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可作为理想的受体菌已构建一系列有效的载体下游培养工艺成熟酵母优点：遗传背景清楚世代时间短，繁殖迅速，可廉价的大规模培养，无毒性基因操作简单可将表达产物直接分泌到胞外，可简化产物分离纯化工艺能对产物进行糖基化修饰能很好的表达在细菌系统中表达不良的真核基因丝状真菌优点：有很强的蛋白分泌能力能正确进行翻译后加工，包括肽的剪切和糖基化修饰，而且糖基化修饰与高等真核生物相似安全，有成熟的发酵和后处理工艺当前研究重点加强对宿主菌遗传背景的研究建立合适的克隆载体和DNA导入方法研究清楚影响基因表达的各种因素及相互关系寻找新的适于不同外源基因表达的宿主菌2.4.3大肠杆菌表达载体的要求载体能独立复制具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记具有很强的启动子，且能为大肠杆菌RNA聚合酶识别应具有阻遏子，使启动子受调控，只有诱导时才能转录应具有强的终止子，以便于转录克隆的外源基因，而不转录其它无关基因所产生的mRNA应具有翻译起始信号，以便转录后能顺利翻译影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因剂量外源基因表达效率启动子强弱核糖体结合位点的有效性SD序列和起始密码子的间距密码子组成外源产物的稳定性细胞的代谢负荷工程菌的培养条件如何提高表达产物的稳定性组建融合基因，产生融合蛋白利用大肠杆菌的信号肽或真核蛋白自身的信号肽，以确保真核基因表达产物分泌到胞浆（外源蛋白不易为细菌酶类所降解）中采用位点特异性突变，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加稳定性采用蛋白酶缺陷型菌株，减弱表达产物的降解细胞代谢负荷外源基因表达产物为异己物质，对宿主菌有毒性，甚至使宿主细胞死亡大量的外源基因表达产物能打破宿主细胞生长平衡，影响其它代谢过程，影响宿主细胞生长和代谢，而细胞代谢损伤又抑制外源产物合成如何减轻细胞代谢负荷措施1：细胞大量生长时抑制外源基因表达措施2：宿主细胞的生长与质粒的复制分开措施3：表达产物形成不溶于水的包涵体可降低对宿主的毒性真核基因在大肠杆菌中表达的形式融合蛋白优点：蛋白质在菌体内稳定，不易被降解，易实现高效表达缺点：融合蛋白只能作为抗原，所以会影响蛋白的免疫原性，一般不能作为人体注射用药非融合蛋白优点：能较好的保持蛋白原有活性缺点：易被蛋白酶破坏，且非融合蛋白氨基端通常带有甲硫氨酸，在体内用药易引起人体免疫反应分泌表达蛋白优点：蛋白质在外周质稳定，无活性的蛋白分泌时则具有活性，不含甲硫氨酸不易为降解，易实现高效表达缺点：产量不高，信号肽不被切割或者不在特定位置切割2.4.4酵母体系中的基因表达载体载体复制序列：Yep、YRp、YCp、Yip克隆载体：要求同时具备在大肠杆菌和酵母中复制和增殖的能力表达载体：普通表达载体：能方便的引入外源基因表达，对表达产物组成，特别是对其N端氨基酸增减并无严格要求精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有限制性内切核酸酶位点，以利于接入外源基因，并使他在表达和加工后N端氨基酸序列与天然产物相同影响目的基因在酵母中表达的因素外源基因剂量外源基因表达效率启动子分泌信号效率终止序列的影响外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响菌株生长能力强菌体内源蛋白酶较弱菌株性能稳定分泌能力强2.5基因工程菌生长代谢特点菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子合成的综合表现，通常用比生长速率来表征。工程菌培养可通过选用不同碳源、控制补料或稀释速率来控制菌体生长。控制菌体生长对提高质粒稳定性，减少代谢副产物积累，提高外源蛋白产率有重要意义。大肠杆菌的蛋白与菌体量的比值是基本恒定的，而菌体的生长速度也反应了蛋白质的合成速度。通过改变培养条件，会影响菌体的能量代谢和小分子前体的供应，进而影响生物大分子合成和菌体生长。菌体生长与能量关系菌体生长由呼吸控制，各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率。当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所提供的能量时，由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能，菌体往往产生代谢副产物乙酸。高浓度乙酸可明显抑制菌体生长。乙酸的抑制作用与培养基pH有关，适当提高pH可减少乙酸的抑制作用。分批培养选用不同碳源，补料培养通过控制补料速度，连续培养通过控制稀释速率都能在一定程度上控制菌体生长，从而减少乙酸产生，减少其抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。菌体生长和前体供应关系在基础培养基中添加氨基酸能使菌体比生长速率提高和蛋白质合成增加。菌体中的小分子前体和催化结构是有限的，因而使生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争是各个基因不想竞争共同的前体和催化结构的结果。由于工程菌质粒的复制和外源基因的转录、翻译，将加剧上述成分的不足，因此工程菌生长速率往往低于宿主菌，特别是在诱导后，由于外源基因的大量表达，菌体比生长速率下降，甚至生长停止。质粒对菌体生长的影响中等拷贝数质粒（56copy）的工程菌，TCL的一些关键酶及与前体合成有关的酶的相对水平增加，这些酶的基因大多是受终产物反馈调节的，外源基因的复制、转录和翻译引起菌体内前体浓度的降低可能是诱导这些酶浓度增加的原因之一。含高拷贝数质粒（240copy）的工程菌与宿主菌相比，宿主菌大量前体被利用，引起前体不足，从而产生“严谨反应”。严谨反应严谨反应是当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留并合成ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控因子，其浓度增加会导致RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，从而使游离RNA聚合酶浓度降低，严谨控制的启动子（如rrnA）转录减少。另一种观点认为，ppGpp通过干扰RNA聚合酶与PL启动子的专一识别反应，而不是通过影响RNA链的延伸过程来减少转录的。由于rRNA启动子受“严谨控制”，当菌体内氨酰tRNA链的延伸不足引起“严谨反应”时，rRNA合成减少，这样翻译水平的前体不足通过ppGpp浓度变化来调节核糖体浓度。2.6基因工程菌的不稳定性基因重组菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件基因工程菌的稳定性至少应维持25代以上2.6.1质粒的不稳定性分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。产生分裂不稳定因素含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；两种菌比生长速率差异的大小，主要由于丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势。产生结构不稳定因素质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个启动子的质粒更容易发生缺失。在无同源的两个位点间也会发生缺失。培养条件。质粒不稳定性分析方法将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10－12h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10－12h，统计长出的菌落数。每个样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。提高质粒稳定性方法（一）选择合适的宿主菌：宿主菌的比生长速率、基因组系统的特性、染色体上是否有质粒与外源基因同源序列等都会影响质粒稳定性。选择合适载体：1）含低拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较大，可通过提高增加质粒拷贝数提高稳定性；2）含高拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较低，但由于大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，因此再增加拷贝数，会增加含质粒菌的生长负势，对质粒的不稳定性不利；3）对同一工程菌，控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数。选择压力：1）抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力；2）添加抗生素在大规模生产时可增加成本，且添加容易被水解的抗生素只能维持一定时间。分阶段控制培养：在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免由于基因表达造成质粒不稳定问题的发生，使质粒稳定的遗传，在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。提高质粒稳定性方法（二）控制培养条件：1）提高比生长速率（温度、溶氧、pH、限制性营养物质浓度及有害代谢产物浓度）有利于提高质粒稳定性。由于重组菌对环境的改变比不含质粒的受体菌反应慢，可通过改变培养条件改变两种菌比生长速率，从而改善质粒稳定性。2）重组菌在复合培养基中稳定性较高，且需要保持较高的溶氧，通过间歇供氧和改变稀释率可提高质粒稳定性。固定化：基因重组菌在固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都会有很大提高。2.7基因工程菌中试中试可以得到大量产品供临床实验，也可将中试所得数据供生产设计时参考。主要考虑问题：适合商品化生产的工程菌设计发酵反应器选择反应过程发酵培养基组分维持生产工艺最佳化的方法工艺检测方法工艺控制方法工艺自动化使用方法生物催化剂使用产物提取纯化方法的选择分离精制技术的选择2.7.1工程菌选择用一般基因重组技术获得有高产潜力能以工业原料为培养基生产工艺能采用一般工业生产经验能产生和分泌蛋白不致病、无毒性，能安全生产符合国家卫生部门有关规定代谢能控制产品有特异性发酵液黏度小2.7.2反应器（发酵罐）设计设计前要考虑问题：1）培养细胞特性；2）细胞生长率；3）发酵罐消毒方法；4）温度、pH、溶氧、二氧化碳及代谢产物；5）后处理效果。设计中要考虑问题：1)根据实验条件需要，能连续发酵，又能分批发酵，并附有加料管、取料管及测量仪表；2)易安装、移动；3）仪表所得数据可靠；4）数据重复性好；5）可任意装置附件，罐体为不锈钢材料，罐体与各附配件均打光，避免残渣积存。2.7.3发酵培养基组成提供化学元素，如碳、氮、氧、氢等提供特殊营养源，如氨基酸、维生素提供能源，如葡萄糖控制代谢，培养基中加入活性物质或改变温度、pH，诱导菌株改变生长速率或代谢途径以增加产量2.7.4工艺最佳化与参数检测控制工艺最佳化：最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳化速度、最低失败率等综合指标。参数检测控制：1）主要参数，如pH、温度、溶氧、CO2；2）生物量：浑浊度、细胞组分、总氮量及菌丝干重；3）碳源：糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质；4）产品。2.7.5计算机的应用计算机记录与控制全部生产过程的数据，使工艺最佳化，产品产量和质量不断提高，原材料与能源消耗不断下降，成本不断降低。2.8重组工程菌的培养良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要，直接影响到产品质量和生产成本，决定产品的市场竞争力。建立有利于纯化的发酵工艺，以提高产品的纯度，改善其性质。2.8.1基因工程菌的培养方式1）分批培养2）补料分批培养3）连续培养4）透析培养5）固定化培养分批培养控制方法DO-Stat法：通过调节搅拌转速和通气速率来控制溶氧在20％，用固定或手动调节补料的流加速率。BalabncedDO-Stat法：通过控制溶氧、搅拌转速及糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度菌体及表达产物。控制菌体比生长速率方法：1）通过调节葡萄糖流加速率以控制溶氧在20％；2）通过搅拌转速控制。2.8.2基因工程菌培养工艺工程菌培养与传统发酵存在很大差异。传统发酵工艺生产生物制品是远远不够的。培养基是提高工程菌生长速率，保持重组质粒稳定性，使外源基因能高效表达。使用不同碳源对菌体生长和外源基因表达有较大影响，如：1）葡萄糖（副产物多）和甘油（菌体得率高）为碳源比生长速率和呼吸强度相差不大，但葡萄糖对lac启动子又抑制作用；2）甘露糖不产生乙酸，但比生长速率和呼吸强度小；3）乳糖对lac启动子有利。接种量是指移入的种子液体积与培养液体积的比例，其大小影响发酵产量和发酵周期。接种量小：菌体延迟期长，不利于外源基因表达。接种量大：利于对基质的利用，可缩短延迟期，减少污染机会。但菌体生长快，代谢产物积累过多，反而会抑制菌体生长。温度可影响外源基因复制（改变基因剂量）、转录（影响RNA聚合酶）、翻译（影响mRNA稳定性）或小分子调节分子合成。温度敏感型质粒，升温后质粒拷贝数处于失控状态，对菌体生长不利。温度还影响蛋白活性和包涵体形成。溶解氧溶解氧浓度对菌体生长和产物生成有很大影响。外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量，以促进细胞呼吸，提高对氧的需求。只有维持较高水平的溶解氧（≥40％）才能提高带有质粒重组菌的细胞生长，利于外源蛋白产物的形成。诱导时机的影响应根据不同菌株的不同特点，并结合培养方式确定最佳的诱导时机。诱导表达程序的影响热诱导程序对提高外源蛋白表达量至关重要，细胞生长温度突然升高10度以上，细胞内会产生某些热激蛋白以适应变化的环境。pH在发酵过程中pH变化是由工程菌的代谢、培养基组成和发酵条件所决定。细胞自身对pH有一定的调节能力，但外界条件变化过于激烈，细胞失去自身调节能力，从而影响细胞生长。工程菌发酵最佳化工艺是指最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果和最低失败率等综合指标。只有对菌种的生物特性和发酵工艺了如指掌，最佳工艺设计才最合理。2.8.3基因工程菌培养设备发酵罐：要防止工程菌丢失携带的质粒，保持基因工程菌的遗传特性。微生物发酵：初级和次级产物，细胞生长并非主要目标。基因工程菌发酵：基因表达产物。因此，培养设备以及控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因产物。发酵罐发酵罐体搅拌器灭菌系统空气无菌过滤装置残留气体处理装置参数测量与控制系统培养液配置连续操作装置发酵罐要求要提供菌体生长的最适条件培养过程不得污染保证纯菌培养培养及消毒过程不得游离出异物不能干扰细菌代谢活动理想发酵罐应当满足如下要求：稳定性要好，一般用不锈钢制成，罐体表面光滑易清洗，灭菌时无死角。与罐体连接的阀门用膜式阀，不用球阀所有的连接接口均用密封圈封闭任何接口不能有泄漏要防止杂菌污染，空气过滤系统要采用活性炭和玻璃纤维棉材料要避免工程菌株的自然界扩散，培养液要经过化学处理或热处理后排放排气口要用蒸汽灭菌或微孔滤器除菌轴封可采用磁力搅拌或双端面密封2.9高密度发酵一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论最高值可达200gDCW/L。高密度发酵可实现在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。高密度发酵优点可提高发酵罐内的菌体密度提高产物的细胞水平量相应的减少生物反应器体积提高单位体积设备的生产能力降低生物量的分离费用缩短生产周期目的：降低生产成本，提高生产效率2.9.1影响高密度发酵的因素细胞生长所需的营养条件发酵过程中的培养温度发酵液的pH溶氧浓度有害的代谢副产物补料方式发酵液流变学特性培养基碳氮比例偏小：会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶碳氮比例偏大：菌体繁殖数量小，细菌代谢不平衡，不利于产物积累

要达到理想效果，需对基质中营养物质的配比进行优化，以满足细菌大量繁殖和外源蛋白表达的需要。溶氧浓度维持较高的溶氧水平不仅利于菌体生长，而且有利于外源蛋白的表达。提高溶氧的方法：采用空气分离系统提高空气中氧分压；将具有提高氧传质能力的透明颤藻血红蛋白基因克隆至菌体中；采用与小球藻混合培养，用藻细胞光合作用产生的氧气直接供菌体吸收。pH是保持菌体最佳生长状态的必要条件。必须及时调节pH使其处于适宜的范围，避免pH激烈变化对菌体生长和蛋白表达产生负面影响。温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。代谢副产物大肠杆菌在发酵过程中会产生一些有害的代谢物质，如乙酸、二氧化碳等，进而抑制菌体生长和蛋白表达。2.9.2实现高密度发酵的方法发酵条件的改进构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌发酵条件的改进培养基选择：菌体的迅速分裂增殖应与生长所需的营养物质相适应，因此应选择易被工程菌利用的营养物质。高密度培养各组分的浓度也要比普通培养基高2－3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。建立流加式培养方式提高供氧能力小结单独考虑营养源、溶氧浓度、pH、温度等是不够的，需要对它们进行综合考虑。对发酵条件进行全面优化，才能尽可能提高菌体密度和基因产物的生成。构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌阻断乙酸产生的主要途径对碳代谢流进行分流限制进入糖酵解途径的碳代谢流引入血红蛋白基因2.10基因工程药物的分离纯化2.11变性蛋白的复性2.11.1