分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(7-1)

分子生物学与生物化学实验

操作、设计与技能PCR实验中常见问题及解决办法李刚副教授标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液10μl

4种dNTP混合物各200μmol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5Unit

Mg2+

1.5mmol/L

加三蒸水或超纯水至50μl。

PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

PCR反应有哪些关键环节？

①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板最容易出现的问题一、模板含有杂质：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定,不宜随意更改。

二、模板发生变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。通常模板发生变异的主要原因是模板切胶回收时间过长（一般应控制在1分钟以内）或无意中将模板置于超净工作台中灭菌所致。

PCR引物常见的问题引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

DNA聚合酶的问题酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR失败是由于忘加了酶。

Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。对于一些难以扩增的模板，建议买PCRBuffer中Mg2+free的PCR试剂，以便自己通过一些预实验找出PCR反应中最佳的Mg2+浓度。

PCR反应体积通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。如果不愿重新摸索条件，一个最简单可行的办法是按照小体积的条件多做几管，最后将PCR产物汇集在一起。

退火温度对PCR的影响退火温度对PCR的扩增来说相当重要，如退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。退火温度可以用引物的Tm值-5度来粗略估计。但是精确的退火温度必须通过预实验来确定（可以使用梯度PCR仪）。有时还有必要用标准的温度计（多用电子温度计，带有金属传感器探针）检测一下扩增仪内的温度控制是否准确，这也是PCR失败的原因之一。

PCR出现假阳性的原因？

假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。出现假阳性的原因主要有：

（1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，这种污染可以通过更换实验场地来解决，有时也可用巢式PCR方法来减轻或消除。

非特异性扩增带出现的原因

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

非特异性扩增带出现的对策（一）其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(98℃变性，68℃左右退火与延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase就是采用的二温度点法)。

非特异性扩增带出现的对策（二）采用热启动PCR：把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下作哪怕短暂的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR则可以大大减少这些麻烦。其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值后才允许反应中的一两种关键成分进入反应。例如在复盖有矿物油的小试验中，所有反应管的一种公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。最近有一种热启动的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其单克隆抗体（Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶），在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体阻遏聚合酶的活性，防止反应开始。非特异性扩增带出现的对策（三）嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很成功的。首先在常规条件下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列。接着对一部分反应物－产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增。这种办法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功。半嵌套式PCR，只第二条引物在目的片段一端的内侧，也同样有效。在基因步行或企图进行5‘或3’端RACE时，由于只有一条引物内部的序列是已知的，经常需要作这种变动。采用嵌套式PCR方法，第一、二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的在第30－35个循环终止会获得更好的结果，这样做减少了产生不需要的高分子量带和成片产物的机会。嵌套式PCR极端敏感，在106基因组DNA背景中一个拷贝的病毒基因也能检测到。第二种形式的假象，即所谓的跳跃PCR，可能不能用嵌套式PCR消除。一些延伸不完全的产物可能偶尔与相邻的DNA片段，也许是相似的基因成分重新配对，这样会产生不需要的产物。在这种情况下，一条或两条引物内侧的序列仍旧存在，但扩增产物的大小不同。出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：载体（常用T载体）比例需实验确定。1：1（插入片段：载体）是最常采用的比例。连接反应通常室温下保温1小时即可，如有必要，也可4℃（16℃）过夜。在这2种温度下，无插入片段的载体会自连，产生蓝斑。而带有插入片段的载体则产生白斑。使用TA克隆方法或平端连接方法（采用高保真DNA聚合酶如Pfu扩增的PCR产物为平末端，此时可利用pUC19载体上的SmaI位点连接PCR产物或采用平端的PCR产物克隆载体）。

PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体或其它非特异性条带。为此需在克隆前做凝胶纯化（即切胶回收目的条带）。

PCR出现smear可能的原因（1）

Smear，也称弥散带、片状拖带或涂抹带。都是由于产生非特异性扩增所致，需要逐个验证：

1、酶、dNTP、引物、模板浓度太大。可以减少这几个组分的用量。

2、退火温度太低。需要升高退火温度，可以先做一个不同温度的预实验或者选用降落PCR。

3、引物特异性不好。引物特异性的好坏可以通过引物设计软件分析，也可以在ncbi比对得知。关于引物是否合成的好，可以电泳看一下。如果只有一条清晰的带就可以了。如果合成的不好，产物自然不特异了，就很容易产生smear。

4、Mg2+浓度的问题。这个成分对产物的特异性是非常重要的，可以做一个梯度实验优化一下。

PCR出现Smear的可能原因（2）假定使用了比较好的Taq酶，且引物没有出现问题，可再考虑如下几点：

1、模板是否过量？

2、退火温度是否可升高1－2度？

3、Mg2＋的浓度是否控制在1.5mM左右?

4、循环数是否过多？

进行多轮PCR时，PCR产物

成片的原因?进行多轮PCR时，如果下一轮PCR反应的起始模板量太大，即使PCR条件是正常的，产物成片现象也可能会出现。总的规则是如果上一轮PCR产物在凝胶上见得到条带，只能用1l上一轮PCR产物的1：104到1：105稀释物作为模板进行下一轮PCR。另外对上一轮PCR产物稀释也降低了下一轮PCR产物出错的概率。很少或没有检测到产物的原因如果已经调整了Mg2＋浓度、缓冲液的pH值和循环产物，而且也增加了循环数，尝试过了较低的退化温度和TDPCR，但在EB染色的凝胶上还是看不到产物（聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶要敏感一些），而阳性对照表明试剂没有问题，下一步该怎么办？延长起始的变性时间和（或）提高温度能增加模板DNA完全变性的可能，以提供最大数量的引物配对位点。这一可选步骤的标准条件是95C变性5分钟，有可能扩增发生了，只是效率不高，如果这样，可通过对干凝胶或印迹的杂交来检测产物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物进行第二次扩增，有可能得到特异产物，这时必须用第一次PCR产物的从1：100到1：10000的一系列10倍稀释物。很少或没有产物可能提示DNA样品中存在抑制物。许多PCR的抑制物已被描述过，它们包括离子性去污剂（如SDS）、酚、肝素等。通过