农残分析6-薄层

薄层色谱法

原理吸附剂展开剂的选配薄层板的制备点样与展开检出定性分析定量分析

概念：薄层色谱法又称薄层层析法.

是利用色谱原理在薄层板上对混合物中各组分进行分离、纯化和分析的方法，是把吸附剂或载体均匀地铺在玻璃板上形成厚度一致的薄层，在其下端点加试样溶液后，放入底部带有溶剂(展开剂或移动相)的层析缸中，展开剂在薄层板上移动至一定高度，使样本中各组分得到分离。

发展：属液相色谱，从柱色谱和纸色谱发展而来，兼有两者的特点。

1938年伊马洛夫用氧化铝、氧化镁在薄层板上分离植物成分；1949年梅赫特等首先用黏合剂研制性能稳定的薄层；1957年斯塔尔改进了仪器，提出了吸附剂规格和操作方法；20世纪60年代用于农药分析，1965年薄层色谱。薄层色谱法的特点是：①展开时间短；一般只需十至几十分钟；

②分离能力强，谱带集中；

③灵敏度高，样品量很少时，点样几-几十微克即可以进行定性；

④显色方便；

⑤仪器简单，操作方便。

一、原理

按分离机制可以分为吸附、分配、离子交换及凝胶色谱法等，后两者在农药分析中极少应用。

1．分配色谱原理：（１）正相薄层分配色谱：以纤维素或水、缓冲液、极性有机溶剂处理过的硅胶为固定相，使用极性较弱的溶剂为流动相。（２）反相薄层分配色谱：使用硅酮、石蜡等非极性的溶剂处理过的硅胶或纤维素作固定相，其极性很小，使用极性较强的溶剂作流动相。

２．吸附薄层色谱法：

在农药分析中主要使用吸附薄层色谱法（１）原理：由于样本各组分的理化性质不同，它们在吸附剂上的吸附作用也不同，各组分随展开剂由原点向预定的前沿移动时，在两相间反复进行吸附和解吸附，吸附强的组分难于被展开剂溶解下来，移动速度小，吸附弱的成分较易被展开剂解吸附，移动速度较大，移动速度的差别，使各成分分离。各组分经展开后在薄层板上迁移距离的数值，可用比移值Rf

来表示。

原点即在薄层板上点加样本的位置，一般在玻板下端约2cm处。展开剂前沿是指展开剂移动的终止位置，同一农药在相同展开剂、吸附剂及相同环境条件下的比移值是不变的，可以作为农药定性的依据。

（2）

影响分离效率的因素主要有以下4点：

a.展开剂的选择和移动速度：展开剂在一定的吸附剂上移动的速度与其极性和黏度有关，因此选择合适的溶剂或混合溶剂作展开剂达到适宜的展开速度是很重要的。

b.吸附剂的颗粒大小：吸附剂颗粒小，分辨率好；但展开速度慢，延长展开时间会增加分子横向扩散或拖尾现象，影响分辨效率；为了获得较好的分离，吸附剂颗粒大小与展开的长度要协调好；如果颗粒大展开剂推动过速而影响分离效果，则展开距离要延长；市售预制板颗粒直径为10~15微米，预制高效薄层板颗粒直径5~7微米，自制板所用的吸附剂为30微米或更大些。

c.合适的展开距离:吸附剂颗粒在30微米时，展开距离以10~15cm为宜；

d.样点的浓度与大小：点样时应使用样本浓缩液，样点的直径尽可能小，点样时应使用样本浓缩液，样点的直径应尽可能小，如点样成条状，则其宽度应窄，即一边点样一边用吹风吹干。点样距板端2cm，板的点样一端浸在展开剂中1cm。二、吸附剂吸附剂的基本要求：①表面积大的、内部是多孔颗粒状的固体物。②具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，吸附后又很容易用溶剂把样品成分从表面解吸附下来，即具有可逆的吸附性，使样品各组分达到预期的分离。③与展开剂和样品中各组分不起化学反应，在展开剂中不溶解。④吸附剂的细度要求在约30一70µm之间(200一300目)。2.吸附剂的种类

淀粉、菊根扮、滑石、碳酸钙、碳酸镁、硅胶、氧化铝、活性碳、纤维素和聚酰胺等。常用的吸附剂主要是硅胶和氧化铝。

①

硅胶形成：是由硅酸钠溶液中加入盐酸而得的溶胶沉淀，经部分脱水而形成的无定形多孔固体，具有微酸性。组成：SiO2.XH2O表示，有多孔的硅氧交联结构，骨架表面有很多硅醇基，能吸附多量水分，此种表面吸附水称为“自由水”，当加热到120ºC左右，能可逆地被除去。交链结构内部有的水称为“结构水”，于高温加热，将不可逆地失去“结构水”，由硅醇结构(I)变为硅氧环结构(Ⅱ)。≡Si－OH≡Si－O－Si≡硅醇基(Ⅰ)硅氧环结构(Ⅱ)

影响活性的因素-----

含水量：吸附剂具有不同的吸附能力，称为活性度，含水量高，吸附力减弱，活性降低；当“自由水”含量高达17％以上时，吸附能力极低，但可作为分配色谱法的载体。

由于硅胶的吸附力主要与硅醇基数量有关，加热温度过高，将不可逆地失去“结构水”，硅胶由硅醇结构(I)变为硅氧环结构(Ⅱ),吸附能力反而降低.

活化：在一定温度下加热除去“自由水”，可以使硅胶的活性提高，而加强吸附力，称为“活化”。

类型：硅胶H——为不加粘合剂的纯硅胶；硅胶HF——加有荧光指示剂的硅胶H；硅胶G——硅胶中混有13％左右的石膏粘合剂；硅胶GF——加有荧光指示剂的硅胶G

②氧化铝氧化铝有酸性、中性和碱性，在薄层色谱中选用中性氧化铝，色谱用氧化铝按含水量多少分为5级，如下表。活性级别

氧化铝含水量（％）

硅胶含水量（％）

Ⅰ

00Ⅱ

35Ⅲ

615Ⅳ

1025Ⅴ

1538

②氧化铝

氧化铝含水量多，活性级别大，吸附性能小，在一定温度下加热除去水分可以使氧化铝的活性提高而加强吸附力，如在400℃马福炉内，加热6h，可得活性在I级的氧化铝，使用时加入一定量的水分，可使活性降低，称为脱活。氧化铝常用于中性和碱性农药的分离，其作用机理尚不清，有人认为其表面吸附了水形成铝羧基，亦是以氢键作用吸附其它化合物，但当氧化铝高温加热至800℃，表面羟基已不存在，吸附活性反而增加，所以推测它可能是通过A1一O键而起吸附作用的。常用的氧化铝制剂与硅胶相似，有氧化铝H、氧化铝HF、氧化铝G和氧化铝GF等。

3.吸附剂的细度

吸附剂颗粒大小对层析速度、分离效果及Rf值有明显的影响，颗粒太大，表面积小，吸附量降低，展开速度过快而分离效果不好，颗粒太小则层析速度过慢，易出现拖尾或横向扩散等现象，吸附剂的细度在30一50µm较好。

三、展开剂的选配

在选择展开剂时，应从被测物质的性质，吸附剂的活性和溶剂的极性三方面考虑：（一）、被测物质的结构和性质：

极性大的化合物可以很容易地被吸附剂吸附，需要极性溶剂才能使之解吸附而向前推动，弱极性的化合物不易被吸附剂吸附；被测物质的结构不同，其极性也不同。化合物中各种官能团的极性由小到大次序为：烷烃(一CH3，一CH2一)＜烯烃(一CH＝CH一)＜醚类(一OCH3，一OCH2一)＜硝基化合物(一NO2)＜二甲胺一N(CH3)2＜酯类(一COOR)＜酮类()＜醛类(一CHO)＜硫醇(一SH)＜胺类(一NH2)＜酰胺()＜醇类(一OH)＜酚类(Ar一OH)＜羧酸类(一COOH)。化合物中双键或共轭双键多，则吸附力增大。

（二）、吸附剂的性能：

分离弱极性的化合物，因不易被吸附剂吸附，须选用含水量小、活性大的吸附剂；反之，分离极性强的物质，须选用含水量多、活性小的吸附剂。（三）、展开剂的选择：

一般情况下，农药极性和硅胶都是固定的，要使待分离的物质有较适宜的比移值，主要通过选择合适的展开剂，展开剂的洗脱能力主要由它的极性决定的，极性大的溶剂溶出能力强。

各种溶剂的极性次序如下：石油醚、己烷＜环己烷＜苯＜甲苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜甲酰胺＜水＜乙酸。展开剂的正确选择是使农药有效成分与杂质分离的关键，可以使用单一溶剂，也可用两种或两种以上溶剂。

展开剂不同，分离效果不同

在农药分析中，薄层色谱仅仅是分离手段，要求展开剂不能对以后的测定方法产生干扰。

如使用薄层-银量法测定农药中所含的氯时，应尽量避免使用三氯甲烷、二氯甲烷等溶剂。

四、薄层板的制备一、玻璃板的规格：10×15（20）cm,20×15(20)cm,7.5×15(20)cm,5×15(20)cm二、吸附剂匀浆的调制：吸附剂：溶剂=1：20.5~0.8mm三、涂布：1涂布器的使用；2自制涂布器；3倾倒法。四、风干五、活化1硅胶板：105~120°C，

1h;2氧化铝：80~100ºC，

0.5h五、点样与展开一、点样：点样量：20~40mg；或0.1~1mL；位置：离底端2cm，两端1~1.5cm；方法：点小，线细，晾干；二、展开：（色谱过程）

点过样品的薄层板，经红外，加热吹风等方式将溶剂挥发尽，放在层析缸内进行展开，层析缸一般三面衬有滤纸，缸内预先放有展开剂，使蒸汽压饱和。展开时，一般使溶剂前沿达到12~16cm即可，或再高些，根据实际情况而定。如果分离效果不理想，也可将薄层板取出晾干后，再换另一种展开剂或原展开剂做同向二次展开。也可用超板展开法，即在溶剂前沿上升到顶端后再展开一段时间。

溶剂饱和对展开效果的影响

①第一块板放人盛有0.5cm二氯甲烷的层析缸中展开，展开时没有用缸盖。

②第二次板放入到内有二氯甲烷的玻璃制的层析缸中，加盖密闭展开，但层析中没有使用被溶剂饱和的滤纸。

③层析缸内壁衬上滤纸。先用展开剂蒸气饱和后再放人第三块薄层板，加盖展开。

六、检出

分离无色物质的混合试样时，展开后需要对待测成分确认和检出，试样展开后的图称为色谱图。

常用检出方法有以下几种：

1）萤光硅胶板在紫外灯下显色将薄板放在紫外灯下照射，在紫外光区有吸收的农药可在白色背景上形成暗紫色谱带。具有芳香环、杂环及共轭双键结构的组分可以用荧光硅胶板方法显色，大多数农药都可用此法。

2）碘显色将固体碘放在层析缸或干燥器底部，使碘蒸气挥发，将簿层板放入碘蒸气中，有的农药几秒钟或数分钟即显出黄色谱带，多数农药可以使用此法。

3）氯化钯显色