分子生物学操作基本技术

质粒操作（提取、酶切、电泳）细菌DNA提取细菌间基因重组讲课内容：一、细菌核酸的基本知识1、染色体主要遗传成分，携带基本代谢的全部基因，呈共价闭合环状(CovalentlyClosedCircle，简称CCC)

，一般只有一条，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。生物分子量（Da）碱基对约数长度（mm）蛙—2.3×10106700人—3×109870果蝇—8×10724脉孢菌2.8×10104.5×107—大肠杆菌2.5×1094.6×1061.5噬菌体T21.3×1083×1050.056λ噬菌体3.2×1075×1040.016多瘤病毒3×106——染色体上编码各种功能的基因比例,%

编码的功能)大肠杆菌(Escherichiacoli)流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)生殖道枝原体（Mycoplasmagenitalium）代谢21.019.014.6结构5.54.73.6运输10.07.07.3调节8.56.66.0翻译4.58.021.6转录1.31.52.6复制2.74.96.8已知的其他8.55.25.8未知38.143.032.02、质粒一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）（1）宿主细胞染色体DNA分子量明显大于细胞所含质粒DNA分子量，如大肠杆菌（Escherichiacoli）染色体的DNA分子为4.6×103kb左右，而通常用于基因工程中的载体一般均小于10kb，1~100×106Da。（2）质粒所携带的遗传信息量较少。携带的遗传信息所一般只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞的生死存亡。

微生物质粒DNA与染色体DNA差别在于：质粒具有下列特性：①

可转移性。即某些质粒可以细胞间的接合作用或其它途径从供体细胞向受体细胞转移。②

可整合性。在某种特定条件下，质粒DNA可以可逆性地整合到宿主细胞染色体上，并可以重新脱离。③可消除性。经某些理化因素处理如加热、或加入丫啶橙或丝裂霉素C、溴化乙锭等，质粒可以被消除。

高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个宿主细胞中有10-100个拷贝）

———————松弛型质粒(relaxedplasmid)低拷贝数(lowcopynumber)质粒（每个宿主细胞中有1-4个拷贝）

———————严谨型质粒(stringentplasmid)窄宿主质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）质粒的相容性：不同质粒在同一宿主细胞内的共存性。有一个复制起始点，能自主复制；具有明显的筛选标记，如：

（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

有克隆位点（MCS外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。基因工程质粒载体的特点本来不能在含青霉素的平板上生长的受体菌在转化子（含有Ampr质粒）周围形成卫星菌落（b-内酰胺酶分泌到胞外所致）克隆载体：pUC18/19

注意：蓝白斑需要诱导启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。纯化标签His-tag和S-tag凝血酶切点蓝白斑筛选需要诱导广宿主载体pBBRMCS系列

复制起始位点通用

Mob负责接合转移蓝白斑无须诱导自杀性载体pSC123

复制起始位点需要特殊蛋白结合

TraJ负责接合转移Mariner负责跳跃pBK-CMV：原核、真核双元表达载体反向筛选标记NucleicAcidResearch,2006,IF:7.552二、针对质粒和总DNA的操作质粒的提取总DNA的提取质粒或DNA片段的酶切酶连电泳酶切产物的回收1.质粒的提取溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；溶液II:0.2mol/LNaOH,1%SDS(现配现用)；溶液III:乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O)；RNaseA：10mg/ml；TE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0。1挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时；2将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000g离心30Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；

离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮3加入100L预冷的溶液I，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；

溶液I中的葡萄糖的作用是增大粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解。4加入200L新配制的溶液II,盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;

溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构

5加入150l溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min；

溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性612000g离心6min，将上清移入另一干净的Ep管中7加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇,振荡混匀，室温放置2min.812000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤一次，12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在真空浓缩系统上干燥质粒；9加入40L含20g/mLRNaseA的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于－20℃或直接用于酶切。细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸2.总DNA的提取基本原理和过程：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。细胞破碎

SDS：SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA和蛋白的分离蛋白质：常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）RNA：常选用RNase消化多糖：提取液中加1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

。DNA纯化（去杂质）1）-70℃冰箱划出保存菌种，30℃LBM培养基培养过夜；2）选取分隔良好的单菌落，接种到200mlLB液体培养基中，30℃，震荡培养过夜；3）4℃，4000rpm，10min回收菌体，用20ml0.85%NaCl，洗涤两到三次；4）去除上清液，用TE缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，室温反应30min；5）加入10%SDS，至终浓度1%，50℃，10min；6）加入20mg/ml的蛋白酶K，至终浓度100μg/ml，温和颠倒离心管数次，37℃过夜反应或50℃3hr。7）加入5MNaCl到终浓度0.7M，充分混匀，然后加入1/10体积的CTAB/NaCl，混匀，65℃，20min；8）冷却到室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，8000rpm,10min，4℃离心，回收水相；9）重复抽提溶液，直至没有白色界面出现，上清加入1/10体积的3MNaAc（pH7.0），0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀；10）用顶端封闭的L型毛细管勾出丝状DNA沉淀，转入70%乙醇中漂洗，晾干片刻，（不可完全干透，否则极其难溶解），于3-5ml的TE中轻轻搅动，使其脱落，4℃放置过夜，使完全溶解。RNase可在step6加入TotalDNAextraction限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。3.限制性内切酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

种

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性核酸内切酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口质粒或DNA片段的酶切过程：

1、在0.5mLEp管中依次加入下列溶液于0.5ml离心管中

提取质粒DNA3.0L10×bufferH1.0lEcoRI2.0U

ddH2O5.8L

10L

2、轻轻混匀,置于37℃水浴中酶解1.5h。

保护碱基：PCR产物末端限制酶切位点的切断情况各种内切酶在不同通用缓冲液中的活性双酶切时通用缓冲液中的选择和方法相邻酶切位点的双酶切效果相邻酶切位点分步酶切时的效果双酶切电泳检测M.Marker;1PCRproduct;2.pET29a/KpnI&XhoI

3~4pET29a-nph/KpnI&XhoI;5.pET29a-nph;6.pET29aM..λDNA/HindⅢMarker;1.pUC19;2.pCFT23.pCFT2/EcoRⅠ;4.pCFT2/EcoRI&PstI4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质(密度与琼脂糖浓度相关)；生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH--4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本不变。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+

等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量，且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②使样品呈色，使加样操作更方便。③形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。DNA分子量标准1.凝胶制备：制备0.8%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴EB，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡（厚度约为3～4mm）；室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子。制好胶后将凝胶连同内槽放在含有1×TAE缓冲液的电泳槽中使用(注意:电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。2.加样和电泳：用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（切记靠近加样孔的一端为负，

80～100V的电压下电泳，一般情况下，电压/电极间距离应小于5V/cm），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。

3.观察拍照操作步骤酶切产物进行制备型琼脂糖电泳，电泳至条带完全分开；在长波紫外灯下切下所需条带，尽量切除多余的琼脂糖，置入1.5mleppendorf离心管中；65℃溶解凝胶，冷却到室温，加入1ml吸附树脂，上下颠倒混匀；将树脂转移到连有吸附柱的注射管上，插入推杆，慢慢将树脂挤入吸附柱；分开注射管，拉出推杆，然后连接注射管和吸附柱，加入2ml80%异丙醇，插入推杆，慢慢推下，清洗吸附小柱；取出吸附柱，放到eppendorf离心管上，10000g，20s离心；将吸附柱转移到新的离心管上，加入预热到70℃左右的TE，放置1min；10000g，1min离心，将所需要的片段收集在离心管内，-20℃保存。（该方法也可以直接回收酶切片段，对于500bp到15kb之间的DNA有很好的回收和纯化效果）5酶切片段回收（(切胶)-树脂吸附-洗脱回收）一般建立如下反应体系：加入0.1μg载体DNA以及等摩尔量的外源DNA。加水至8.5μl，于45℃热激5min，使重新退火的粘端解链，将混合物冷却到0℃，加入1μlT4连接酶缓冲液和0.5μlT4连接酶，16℃，酶连4小时以上，再4℃酶连过夜。6酶连三细菌基因转移的方式细菌的三种水平基因转移形式接合转导转化接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体作为载体介导转化(transformation)：游离DNA分子+感受态细胞（一）细菌的遗传转化（genetictransformation）定义：游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。1、转化1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行转化，需要二方面必要的条件：受体细胞处于感受态：最容易接受外源DNA的一种生理状态。转化因子：外源游离dsDNA分子

以革兰氏阳性的肺炎双球菌为材料，其转化过程大体是：1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合。2、在位点上的DNA发生酶促分解，形成平均分子量为（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA双链中的一条单链逐步降解，同时，另一条单链逐步进入细胞。4、转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。5、受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。转化全过程转化整合过程转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率低b）不需要活的DNA供体细胞；人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。（二）细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导1普遍性转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导给体细菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程普遍性转导过程2局限性转导（specializedtransduction）把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）3局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）普遍性转导是误包；局限性转导是误切。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性，包装的可能全部是宿主菌的基因。(三)细菌的接合作用(conjugation)接合作用：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息转移和重组过程证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）2.机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107Da

，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛

不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛F因子的四种细胞形式a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。1）F+×F-杂交杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。感受态细胞的制备转化双亲杂交三亲杂交四、细菌基因重组的方法感受态细胞：所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割。

基本原理：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化1感受态细胞的制备1、从新活化的E.coliDH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养（细胞密度在5×107个/ml左右），并转装到1.5mL离心管中；3、培养物于冰上放置20min；4、0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞,冰浴20分钟；（CaCl2纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率

）5、0～4℃，

4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；6、0