生物化学14 DNA的生物合成

她们为何如此相象？基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位，通常是指染色体或基因组的一段DNA序列。复制翻译

蛋白质（病毒）RNA（病毒）逆转录中心法则（Thecentraldogma）:遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程。转录RNA翻译蛋白质DNA复制1958年Crick，1970年Temin复制(replication)是指使子代细胞得到和亲代相一致的遗传物质，DNA复制是以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)【目的要求】一、掌握半保留复制的概念。二、掌握DNA复制的基本特征和过程。三、掌握DNA复制的原料、参与的因子和各种酶类。四、熟悉逆转录的概念及基本过程。执考大纲要求的知识点中心法则（1）DNA生物合成的概念

（2）DNA的复制(参与体系和过程？)

（3）逆转录

（4）DNA的损伤与修复本章主要内容：DNA复制的基本特征(重点掌握）

DNA复制的酶学和拓扑学变化(重点掌握）原核生物DNA复制过程(重点掌握）真核生物DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式DNA复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)DNA复制的主要特征一、DNA以半保留方式进行复制

DNA合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。子代DNA和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合式——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代密度梯度实验

重氮DNA重氮DNA重氮DNA按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区称为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)

顺解链方向生成的子链，复制为连续进行，称为领头链。

另一股链复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，称为随从链。

复制中不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。三、半不连续复制DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication参与DNA复制的物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。复制的基本化学反应是生成磷酸二酯键(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi聚合反应的特点:DNA新链生成需RNA引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物有3种DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶２个核心酶1个-复合物（、、、、、

6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：功能：DNA-polⅠ（109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。二级结构以α螺旋为主，只能延长约20个核苷酸。323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：

1.严格遵守碱基配对规律；DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6）复制保真性的酶学机制：2、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性依赖DNA-pol对碱基的正确选择DNApolIII在催化磷酸二酯键形成之前完成对碱基的选择。3、复制的保真性依赖DNA-pol对碱基的正确选择三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态1、解旋酶(helicase)功能:断裂互补碱基间的氢键，使DNA双链分离成单链。解螺旋酶ATP解旋酶Rep蛋白，DnaB功能:利用ATP供能，把双链DNA解开成单链。DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链2、拓扑异构酶(topoisomerase，Topo)解链过程中正超螺旋的形成

切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ:

临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。22/62Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接。动画3、单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)

功能：稳定已经解开的单链，防止核酸酶的水解。

DNA结合蛋白由177个氨基酸构成的四聚体蛋白5´

5´RNA引物5´3´5´3´4、引物酶(primase)DNA合成需在RNA引物的基础上进行催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶？依赖DNA的RNA聚合酶对利福平不敏感HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’5、DNA连接酶连接复制中的单链缺口DNA连接酶的作用：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：参与DNA复制的物质各有什么作用呀？原核生物DNA复制过程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三节起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。

需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、复制的起始E.coli复制起始点oriC

GATTNTTTATTT

···GATCTNTTNTATT

···GATCTCTTATTAG

···11317293244···

TGTGGATTA

-‖-

TTATACACA

-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5353（一）

DNA的解链A--TA--GTGTTTATACACATTATCCACAAATAGGT--T回文结构AGCT

TCGAE.coli复制起始点oriC跨度为245bp原核生物的复制起始部位及解链

DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶（DnaB蛋白）、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。功能：解开成单链，生成引物。引发体3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶引发体和复制叉的生成

二、DNA链的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。后随链的合成

在复制叉同时合成前导链和后随链复制过程简图原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500三、复制的终止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

子链中的RNA引物被取代真核生物DNA生物合成过程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四节(自学为主)真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。真核生物与原核生物DNA复制的差异：哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。一、真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象。DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换3553领头链3535亲代DNA后随链引物核小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒酶：由RNA与蛋白质组成，具逆转录酶活 性，以自身RNA为模板合成端粒DNA。（TTAGGG）n末端DNA序列：端粒（Telomere）：是真核生物染色体线性DNA分子末端的一种特殊结构。53355335+5333355端粒酶催化作用的爬行模型真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第五节双链