生物分离技术11 超声微波包涵体

超声波辅助技术超声波原理人耳的听觉范围大约在20~18000Hz，高于这个频率范围的声音听不见，称为超声。声波通过在介质中压缩、膨胀来实现传播。超声波是一种能量传播方式超声波的特点1.比通常的声波频率高很多，波长短很多。2.同光波相似，具有反射，折射，散射，聚焦等几何光学定律。3.比普通声波强大的多的功率。4.介质对超声波的吸收比对声波大的多，因此其传播距离短的多。5.对介质可产生显著的声压作用。超声效应1.机械效应：由于超声的传播引起介质的压缩和拉伸，造成介质的运动，由于频率很高，故振动加速度很大，其运动加速度可达到重力加速度的数万倍，形成强烈的机械运动效应，甚至可以断裂粉碎物质。2.声流效应当超声波射入两个具有不同声阻的介质界面时，动量发生变化，产生辐射压力，引起撕裂，可对生物组织造成损伤。3.热效应超声波频率高，能量大，被介质吸收时能产生显著的热效应。4.空化效应

超声传播于液体介质中时，由于剧烈的膨胀和压缩，导致液体内部的小气泡，以及局部产生超过液体分子间作用力的小气泡，在声压的作用下，气泡不断运动迅速长大，而后突然破裂闭合，破灭时周围液体突然冲入气泡产生高温、高压，同时产生激波。局部瞬时温度可达200度以上，上千个大气压。

微小空间内的高温高压，机械剪切力，以及由于高温高压使周围的液体超临界化，因而使得溶解、传质和反应速度大大加快。空化是超声应用中最重要的一种效应，具有如下特点：

1.波长越大，空化越明显

2.温度高，易于空化

3.液体中含气量高有助于空化

4.超声波频率增高，外界气压增大，黏度大，空化减弱超声波的综合效应可以充分打碎细胞，搅拌，促进分子运动，帮助目标分子充分与溶剂混合，加速扩散，乳化等，帮助萃取的进行。选择合适的声波参数，使萃取液达到最大空化状态，有助于超声提取的分离效果。超声波具有如此杀伤力，为什么可以用于医学检测？超声波的应用超声萃取用于从动植物中提取药物或其他成分获得非常好的效果，可以实现很好的细胞破碎效果和萃取效率，尤其是在天然植物药用成分的萃取生产方面很有优势。超声萃取具有以下优点：1.提取时间缩短，能耗低，提取效率高2.萃取温度低，不会破坏具有热不稳定、易水解或氧化特性的有效成分3.常压操作，工艺简易安全，设备投资低4.适用范围广，与溶剂和目标物质的性质没有关系。超声悬浮利用驻波在声场中的辐射压力与固体液体微粒或生物细胞的重力相平衡，而使其稳定悬浮在声场中的技术。超声凝聚当超声通过有悬浮颗粒的流体介质时，会带动悬浮颗粒一起振动，而大小不同的粒子的振动相位和振幅各不相同，从而使颗粒互相聚集从而凝聚。例如用于酒类，饮料，酱油等的澄清，常规静置法需要4~10天，使用超声法处理酱油只需1~2分钟，对葡萄酒用超声只需处理1~2h即可完全沉淀。超声过滤超声驻波过滤：1、节点分离2、促使凝聚。3、使不溶物质悬浮，从而给溶解成分留出通道。超声蒸发超声蒸发为热敏性物料的蒸发浓缩提供了理想途径。利用超声的作用，使液体雾化，使液体的蒸发面积大大增加，挥发速度也大大增加，使物料在较短时间和较低温度下快速除去水分。超声干燥具有增加物料内部水分扩散，加快水分迁移，使物料产生自热，降低水分粘性，产生气泡，驱使水分从毛细管中排出。相比常规干燥方法，具有干燥速度快，温度低，干燥程度高，对产品的破坏小等优点超声乳化和破乳利用超声能量和空化作用，可将水珠打散并均匀分布在油中，可以减少或不使用乳化剂，就能生成稳定的乳化油，形成的乳液平均尺寸小，浓度高，可以控制乳液的类型。而使用混合声强超声可使乳化液破乳，实现油，水，固体的分离。超声降解由于超声的造成的极高运动速度，产生激烈的机械振动，分子在介质中随着波的高速振动及剪切力降解。超声形成高温高压的微环境，引起自由基的增加，促进氧化还原反应的进行。用于水体的有机污染的处理等领域，具有简单，快速，高效，无污染等优点

超声脱附用于其他分离技术的吸附分离单元的辅助解吸。超声结晶超声可以代替常规晶种，加快结晶，提高结晶产品性能，有效改善晶体产品的后处理过程。超声杀菌超声波分离应用展望超声波分离时间较短，过程效果增强，在分离提取方面具有很好的推广应用价值，目前多数超声分离技术仍仅限于实验室规模，其主要原因是其工程放大的问题。微波辅助分离技术微波辅助分离技术微波是一种电磁波，以直线方式传播，并具有反射、折射、衍射等光学特性。微波遇到金属物质会被反射，但遇到非金属物质则能穿透或被吸收。微波的电场频率介于300MHz~300GHz之间。微波原理微波是一种电磁辐射，被辐射物质的极性分子在微波电磁场中可快速转向并定向排列，产生的撕裂和相互摩擦将引起物质发热，即将电能转化为热能，从而产生强烈的热效应。因此，微波加热过程实质上是介质分子获得微波能并转化为热能的过程。微波的加热方式的特点微波加热的整体快速：微波萃取主要是利用微波强烈的热效应，但微波加热方式不同于传统的加热方式，是同时直接作用于内部和外部的介质分子，使整个物料被同时加热，即为“体加热”过程，从而可克服传统的传导式加热方式所存在的温度上升较慢的缺陷。微波加热的选择性：体系的极性越大，对微波的吸收越大，极性小溶剂吸收微波能力也较弱，所以加热效应也相对较差，若样品和溶剂均不吸收微波,则微波加热过程无法进行。微波辅助萃取原理：在微波萃取过程中，微波能迅速转化为热能而使细胞内部的温度快速上升。当细胞内部的压力超过细胞的承受能力时，细胞就会破裂，有效成分即从胞内流出，并在较低的温度下溶解于萃取介质，获得被萃取组分。微波萃取的特点1.快速高效2.加热均匀3.加热具有选择性4.不具有热惯性，易于控制5.试剂用量少，节能，污染小微波萃取的选择性利用吸收微波能力的差异可使原料物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被萃取物质从基体中分离出来，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中。从原理上说，传统的溶剂提取法，如浸渍法、渗漉法、回流提取法、连续回流提取法等，均可加入微波进行辅助提取，从而成为高效提取方法。微波萃取的局限性1.对于热敏性物质，微波加热可能使其变性或失活。

2.微波萃取要求材料具有一定的吸水性，否则细胞难以吸收足够的微波能而将自身击破，产物也就难以释放出来。

3.微波萃取过程中细胞因受热而破裂，一些不希望得到的组分也会溶解于溶剂中，从而使微波萃取的选择性降低。

微波萃取的主要影响因素

1.破碎度：被提取物经过适当破碎，可以增大接触面积,有利于萃取过程的进行。

2.分子极性：在微波场中，极性分子受微波的作用较强3.溶剂：在微波萃取中，一次提取所需的溶剂用量可减少30%～60%。溶剂用量较大反而不利于提取，因为微波在穿透溶剂的过程中会发生衰减，溶剂越多，使得到达基体物质的微波能越少，提取效果就越差。

提取物料中若含不稳定或挥发性成分，则宜选用对微波高度透明的溶剂如正己烷等作为提取介质。将材料浸没于溶剂中，在微波场的作用下，材料中的挥发性成分因显著自热而急速气化，冲破组织，从材料中逸出。此时，包围于药材周围的溶剂因没有自热，可捕获、冷却并溶解逸出的挥发性成分。

用水作溶剂时，细胞内外同时加热，破壁的效果不会太理想，且大部分微波被溶剂所消耗，此时可先用微波处理经浸润后的干材料，然后再加水或有机溶剂来提取有效成分，这样既可节省能源，又可简化微波提取装置。4.温度与时间微波提取有可能导致体系的温度过度上升，为减小高温的影响，可将微波提取过程分次进行，即先进行一段时间的微波提取，然后将体系的温度冷却至室温再进行第二次微波提取，从而可最大限度地降低被提取成分因受热而发生破坏的危险。微波萃取的安全性问题1.微波辐射的防护2.有机溶剂的易燃性微波萃取制备系统1.封闭式2.敞开式3.连续流动式

1、封闭式（高压式）

常用于一些猛烈条件下的萃取，反应温度可高于100度。萃取时间短，萃取效率高，试剂消耗少需要注意安全问题，特别是在使用挥发性溶剂的情况下，必须有高能排风体系和压力安全装置，并在开启容器前冷却到室温。

2敞开容器系统系统内有冷却装置，在大气压下工作相对更加安全，处理量更大。1.微波炉2.瓶架

3.蒸馏瓶4.搅拌器5.铜管6.冷凝管7.开关8.控制面板3.连续流动式

萃取溶剂连续流动而样品随之流动或固定不动的一种微波萃取体系，可以与检测仪器相偶联，进行实时监测。基因工程菌重组蛋白原核生物与真核生物基因表达有什么区别？用原核微生物表达真核基因会如何？蛋白包涵体什么是包涵体重组基因工程菌生产蛋白质，其表达形式可以是分泌表达、胞内可溶性表达、胞内不溶性表达。由外源基因在宿主细胞中表达的不溶性蛋白聚合体称为包涵体。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余还含有核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白，质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。E.coli是常用的基因工程宿主菌，包涵体常见于大肠杆菌中，但其他菌种也可以形成包涵体。当重组蛋白以包涵体形式存在时，就需要对包涵体进行变性复性处理。对包涵体的变性复性是重组蛋白药物生产中最关键的技术之一。包涵体的特点1.是由宿主菌表达的外源基因的蛋白产物。2.包涵体密度高、折光性强，形态容易观察到。3.具有不溶性，可通过离心将其和其他可溶性蛋白分离4.不易受蛋白酶影响5.无生物活性6.具有普遍性，很多在E.coli中表达的真核基因产物都以包涵体形式存在。包涵体形成的机制

包涵体形成的根本原因是基因的高水平表达。即使是内源性蛋白，表达过量时也会形成包涵体。活性蛋白的合成包括，肽链的合成，蛋白的折叠，蛋白的聚集。如果新生肽链的速率超过蛋白正确折叠的速率，就会导致包涵体的形成。包涵体形成的机制

包涵体是由部分折叠的中间体之间的错误聚合而发生聚集形成的，即不是由完全舒展的肽链或成熟的蛋白质聚集成的。

UINU：解链态，I：折叠中间体，N：天然态蛋白聚集物主要作用是重组蛋白之间的疏水作用，二硫键的错配也有影响。影响包涵体形成的因素1、表达量过高，在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合等。2、重组蛋白的氨基酸组成：一般含硫氨基酸越多越易形成包涵体，脯氨酸，天冬氨酸，甘氨酸的含量与包涵体的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4、重组蛋白是异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，如分子伴侣蛋白(分子自组装与蛋白折叠)，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。包涵体的利与弊优点：1.具有高密度，不溶性，易于分离纯化。2.抗蛋白酶消化，稳定不易被降解。3.包涵体无活性，对于生产对宿主菌有毒害作用的蛋白产品时十分有利。4.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。

5.对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，与细胞膜碎片分离。缺点：1.包涵体需经过变性复性处理，过程中常常伴有蛋白的水解和沉淀，形成异构体，引起蛋白质的不可逆修饰及性质改变。导致蛋白产量降低2.要加入各种变性剂，复性试剂，表面活性剂等试剂，操作繁琐，成本昂贵。包涵体的纯化与复性目的与思路：1.使原本紧密聚集的蛋白包涵体分散开成蛋白单体。2.使分散开的蛋白单体重新正确折叠为具有生物活性的蛋白质。包涵体的纯化与复性步骤：1.包涵体的提取基因工程菌发酵液，经离心浓缩后破壁，然后以5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。2.洗涤为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,如尿素和盐酸胍，过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，此外还可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。3.溶解变性剂：一般用强变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl6M），打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，盐酸胍是较尿素强的变性剂，能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。去垢剂：如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。但是由于SDS较难彻底的去除而限制了其使用。极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。

还原剂：如果蛋白间存在二硫键，在溶解时还应使用还原剂。还原剂一般是DTT，对于没有二硫键的某些包涵体，有时还原剂的使用也是有用的，可能是由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

4.纯化包涵体溶解后进行纯化有助于提高复性率，纯化的方法主要有膜过滤，电泳，色谱等。5.重组蛋白质的复性使散开的蛋白肽链重新折叠成正确的高级结构，从而恢复其生理活性。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键重新正常形成。变性蛋白过渡态蛋白天然态蛋白影响复性效率的因素蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的重要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。pH：复性缓冲液的pH值应在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-