高效液相色谱法简介

高效液相色谱法

High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC主要内容第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节高效液相色谱类型第四节固定相和流动相的选择第五节图形结果分析及其应用第一节概述

高效液相色谱（HPLC）也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分析。发展历史20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末，科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。20世纪70年代，高效液相色谱法开始广泛应用。高效液相色谱的特点高压——压力可达150～300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速——流速为0.1～10.0mL/min。高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

第二节高效液相色谱仪高效液相色谱仪基本装置流动相进样阀注入样品液色谱柱检测器色谱处理机高压泵流出液高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪一般可分为四个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处理等。1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很小约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。1、高压输液系统3）高压泵

注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。◆恒流泵

往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。

高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。对流量变化敏感的检测器会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。（使用较多）

输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范围宽③输出压力高，一般应能达到150～300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

4）梯度淋洗装置：梯度洗脱有两种实现方式：一是高压梯度（内梯度），利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合均匀后再进入色谱柱。二是低压梯度（外梯度），通过比例调节阀，将两种不同极性的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合，随后打入色谱柱。高压梯度低压梯度2、进样系统

早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：（1）隔膜进样（2）停流进样（3）自动进样（4）阀进样（1）隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受到局限。（2）停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。（3）自动进样。用于大量样品的常规分析。（4）阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。图六通进样阀

分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。3、分离系统

色谱柱发展趋势：

填料粒度小柱径小标准柱型：4.6mm或3.9mmL:15-30cm填料粒度：5-10m装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。

湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入色谱柱，洗净备用4、检测系统检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。要求：灵敏度高噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）线性范围宽重复性好适用范围广分类：1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。4）按破坏性还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。a.紫外检测器（UD）b.荧光检测器（FD)c.示差折光检测器(RID）d.安培检测器e.电导检测器f.蒸发光散射检测器(ELSD)检测器介绍a.紫外检测器(ultravioletdetector)

UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。检测原理：朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl特点：灵敏度较高（10-6—10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液（1）固定波长检测器：254nm（2）可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200—400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似（3）光电二极管阵列检测器

(photodiodearraydetector；PDAD)：1024个二极管阵列，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。类型：光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱－色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展，如图所示。光电二极管阵列检测器b.荧光检测器

(fluorescencedetector；FD)检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；荧光强度

(F)与激发光强度

(I0)及荧光物质浓度

(C)之间的关系为：

F=2.3QKI0εCl

Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。

F=KC

特点：选择性好，专属型检测器，灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10g/ml）对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector，RID）原理：可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比；

除紫外检测器之外应用最多的检测器；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低（10-6g）、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；d.安培检测器

由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成。如图。原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)e.电导检测器

电导检测器主要用于离子色谱的检测。原理：根据待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。电导检测器不能用于梯度洗脱。f.蒸发光散射检测器（ELSD）原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。蒸发光散射检测器示意图色谱数据处理HPLC通常配有记录仪、积分仪或色谱工作站等，以完成对检测信号的记录、处理和控制等。第三节

高效液相色谱分析法一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱七、亲和色谱(AC)

主要分离类型与原理一、液-固吸附色谱

固定相：硅胶、氧化铝等;流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸;吸附系数K不仅取决于[X固相]与[X液相]的比值，还取决于溶剂分子S的吸附能力。K大，表示该溶剂分子吸附能力强，后流出色谱柱，后出峰。

K=

二、液-液分配色谱

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配不同K是分配系数，K大，保留时间长，后流出色谱柱。

K=

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出三、离子交换色谱

固定相：阴、阳离子交换树脂流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；反之。基本原理：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质进行可逆交换，依据这些离子在交换树脂上有不同的亲和力而被分离。阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

离子交换色谱的分离机理1、不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。2、P0：流动相中溶质的浓度Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度D0：流动相中洗脱剂的浓度Db：填料表面上洗脱剂的浓度Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。①Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数②在Z值不能忽略时在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K’与保留体积成比例，同时洗脱过程中，Kd，Db是常数，用Kz表示。离子交换色谱的影响因素1、填料孔径的影响2、柱长的影响3、流速的影响4、PH值的影响四、离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。

五、离子对色谱

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。六、排阻色谱色谱

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小和形状不同分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

七、亲和色谱(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。载体LX配基待分离物质亲合色谱影响因素1、平衡和平衡缓冲溶液2、蛋白质的浓度和温度效应3、特异性洗脱4、非特异性洗脱(受缓冲溶液中的PH值，离子强度，温度和介电常数的控制。)影响分离的因素与操作条件的选择(一)影响分离的因素

1、在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+Cu

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如下图所示。2、流速

流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。

3、固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。（二）分离类型选择（见下页表）分离类型选择（choiceofseparationtypes）第四节固定相和流动相的选择一、固定相

1、高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。

2、固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类固定相的要求：①颗粒细且均匀；②传质快；③机械强度高，能耐高压；④化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。二、流动相

正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长

要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明，它严重干扰组分的吸收测量。（3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

第五节图形结果分析及其应用色谱图(Chromatogram):

色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值色谱数据处理分离柱检测器记录仪积分仪色谱工作站色谱仪信号输出方框图色谱数据处理通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。

数据处理原理：◆峰的检测◆

数据采集◆基线校正和重叠峰的分离

自动处理人工修正●峰的检测峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：切线色谱峰的判断最小面积▲依照信号斜率的变化检测信号▲依照积分面积检测峰信号

保留时间和峰面积的计算●基线校正和重叠峰的分离在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂移值参数来解决

色谱仪自动定性和定量分析

◆“时间窗”法(TimeWindow)：tR±Δt

对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗”，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。◆“时间带”法(TimeBand):tR(1±a%)

对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。高效液相色谱的定性和定量分析

1.定性分析在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（tR′或VR′）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。

2.定量分析基本方法有内标法、外标法等。

外标法———标准曲线法是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。实验仪器的基本操作1、开机，启动装置，进入Win2000；开启LC，点击Instrumentlonline图标，进入仪器控制面板，设置所需各项参数。2、设置分析用流动相清洗流路,等待色谱柱、系统的平衡，基线稳定，开始进样分析。3、分析结束，数据处理，打印报告。4、关闭柱温箱和检测器，冲洗色谱柱，关闭脱气机、泵，关闭整个装置。