消毒灭菌,肠道致病菌分离培养和抗酸染色

实验二

三.抗酸染色

一.消毒灭菌二.肠道致病菌的分离培养一、消毒灭菌物理因素对细菌的影响2.化学因素对细菌的影响（一）物理因素对细菌的影响高压蒸汽灭菌法紫外线对细菌的影响高压蒸气灭菌法

原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力的作用压力不断升高，蒸汽的温度也相应升高，在103.4kPa蒸汽压力下时，温度可达121.3℃。维持15-20分钟后可杀死细菌包括芽孢在内的所有微生物。高压蒸气灭菌器

1)构造

高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。高压蒸汽灭菌法压力：1.05kg/㎡

或103.425KPa温度:

121.3℃时间：15-20min完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。2)使用方法

①加水至锅内达规定的水平面，放入欲灭菌物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭。②用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空气逸出，待空气全部排出后，关闭排气阀。③继续加热并观察压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（例如15磅）即调节热源，维持20～30min．可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。④灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。3)注意事项

①检查排气活塞及安全阀门，特别是压力表的性能是否正常，以免发生危险。②灭菌物品不应放置过挤，妨碍蒸气流通，影响灭菌效果。③灭菌开始时必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力，灭菌将不彻底。④灭菌过程中及灭菌完毕，灭菌后切不可排气过急，突然打开排气阀门放气减压，以免瓶内液体外溢或者破裂。全自动高压蒸汽灭菌锅台式蒸汽灭菌器BA-30SystecD-2002D双门高压灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器(型号YXQ-WY21-600)全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅

电脑全自动水浴式串联杀菌锅紫外线对细菌的影响原理：紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰DNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。对病毒也有破坏作用。特点：紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。紫外线中波长为240-300nm者具有杀菌能力，其中265-266nm的杀菌作用最强。用途：常用于消毒物体表面，手术室无菌实验室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。紫外线对细菌的影响

方法：取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下照射30分钟，然后盖好盖子，置37℃培养24h后取出观察结果。纸片平皿盖滤纸片用后需要用火烧掉每个实验室4个平板密涂接种

分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。1.促进菌体蛋白质变性或凝固;2.干扰细菌酶系统和代谢;3.损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理结构和生理活动。有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。（只能外用，对细菌的敏感性不同）（二）化学因素对细菌的影响

化学消毒剂分类高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于不耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内窥镜等。如：次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结核杆菌），真菌和大多病毒，适用于喉镜，麻醉器材等。如：碘酊、乙醇等低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽孢，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。如：新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等化学消毒剂对细菌的影响方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精、碘酒或新洁尔灭进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37℃温箱培养24小时后观察。

（每个实验室4个平皿）二、肠道致病菌的分离培养肠道致病菌的生物学性状

SS培养基的特性及用途分离培养方法肠道杆菌的生物学性状埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科重要菌属及代表菌种1、相似的形态染色—从形态上无法区别

中等大小的G-杆菌

多有鞭毛、菌毛肠道杆菌的生物学性状2、活泼的生化反应肠道杆菌的生物学性状乳糖发酵试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵乳糖

多数发酵乳糖肠道杆菌的生物学性状

-/+

-

+伤寒杆菌

-

-

+痢疾杆菌

-

⊕

⊕大肠杆菌硫化氢乳糖葡萄糖菌名2、活泼的生化反应SS培养基的特性

（Salmonella-ShigellaMedium）胆盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能部分抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长。中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红。常用于培养肠道致病菌。牛肉浸粉蛋白胨乳糖硫代硫酸钠枸橼酸钠煌绿胆盐中性红琼脂Salmonella-ShigellaMedium主要成分基础营养乳糖指示剂抑制剂分解乳糖不分解乳糖产酸PH下降指示剂变红色红色大菌落大肠杆菌等无明显变化无色半透明小菌落志贺菌、沙门菌大肠杆菌痢疾杆菌

SS平板大肠杆菌

粉红色大菌落痢疾杆菌无色细小半透明菌落伤寒杆菌无色细小半透明菌落SS培养基的特性及用途将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。(每个实验室8个平板，接种好后，做好标记，用胶布按班绑好）

注：每个平板只可操作一次，不可重复操作放入37℃温箱中培养24小时。取出放4℃冰箱中保存备用。肠道致病菌的分离培养方法【实验目的】1.掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义。2.熟悉抗酸染色的原理。

三、抗酸染色（Acidfaststain）分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。【实验原理】细菌：卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）

染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美兰溶液

其它：接种环、酒精灯、载玻片、玻片夹等

【实验材料】1.细菌涂片的制备

涂片干燥固定

2.染色1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处（2-10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热3～5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。2）脱色：3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。3.用油镜观察【方法与步骤】（与革兰染色的差别）【实验结果】未染色初染后脱色后复染后初染脱色复染石炭酸复红盐酸酒精碱性美兰

结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈蓝色。【注意事项】1.无菌操作2.染色