核酸的化学3学分

第五章核酸的化学核酸的种类、分布、功能核酸的组成成分DNA的结构RNA的结构和功能核酸的性质核酸的序列测定1868年，瑞士Miescher发现核酸。1889年，Altmann提出核酸概念。1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，是20世纪自然科学最伟大成就之一。1958年，Crick提出遗传信息传递的中心法则，并于1971年修改了该法则。1961年，Jacob和Monod提出操纵子学说1966年，Nirenberg等破译出遗传密码1981年，Cech发现核酶（Ribozyme）1983年，Simons等发现反义RNA20世纪70年代，诞生DNA重组技术。并诞生基因工程。20世纪90年代开始实施人类基因组计划，开始进行基因组学研究。生物技术产业空前发展。核酸的研究历程20世纪40年代末，Avery的“肺炎双球菌转化”实验证明DNA是有机体的遗传物质：DNA无荚膜，不致病温育有荚膜，致病传代传代有荚膜，致病有荚膜，致病有荚膜，致病一、核酸的种类、分布、功能Ⅰ种类脱氧核糖核酸（DNA）：是主要的遗传物质。核糖核酸（RNA）

tRNA

(15%)mRNA

(3-5%)

rRNA

(80%)

其它RNA：如反义RNA等

所有生物细胞都含有DNA和RNA这两类核酸，而病毒只含DNA或RNA。

Ⅱ分布p473DNA原核生物真核生物拟核质粒染色体（质）细胞器：如线粒体、叶绿体等RNA：核内（snRNA、hnRNA）、胞质(scRNA)、细胞器

Ⅲ功能p475DNA：是主要的遗传物质，遗传信息以密码形式编码在核酸分子上，表现为特定的核苷酸序列。RNA参与蛋白质合成tRNA：转运、识别rRNA：装配、催化mRNA：信使、模板多种细胞功能——参与基因表达的信息加工和调节

真核生物染色体DNA是线型双链DNA。原核生物的染色体DNA、质粒DNA和真核生物的细胞器DNA都是环状双链DNA。细胞RNA通常都是线型单链，但病毒RNA则有线型与环状、双链与单链之分。RNA的5种功能控制蛋白质合成作用于RNA转录后加工与修饰基因表达与细胞功能调节：如反义RNA、RNAi（RNA干扰）生物催化与细胞持家功能（细胞基本功能）遗传信息的加工与进化

生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代。通过RNA转录和蛋白质翻译使遗传信息在子代中得以表达。－基因表达二、核酸的组成成分p478核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase

嘧啶碱pyrimidinebase（碱基base）核糖ribose

(或脱氧核糖deoxyribose)

（戊糖amylsugar）核酸是由核苷酸组成，含磷较多，酸性较强的高分子化合物。（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚(地衣酚)FeCl3绿色产物Δ脱氧核糖+H+

Δω-羟基-γ-酮戊醛二苯胺蓝色产物RNA和DNA定性、定量测定（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤PuNH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶Py123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPOPO--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用：ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成第二信使——cAMPHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHHAO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（basesequence)。通常碱基序列由DNA链5′→3′方向写。（一）DNA的一级结构三、DNA的结构DNA的四级结构一级结构：由多个脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特定构象。如超螺旋等。四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。1.双螺旋结构的主要依据（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。（2）Chargaff规则——在双链DNA分子中，碱基摩尔数存在下列关系：①A=T②G=C③A+C=G+T④A+G=T+C

（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。后Pauling和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。2.双螺旋结构模型要点p486（1）主链：两条多核苷酸链反向平行。两条链均为右手螺旋。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行；（2）碱基：碱基位于内侧，碱基互补配对，A与T、G与C配对。（3）螺距：双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。

(4)大沟和小沟（二）DNA的双螺旋结构——1953年，Watson

和Crick

提出。3.双螺旋结构的稳定因素（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（basestackingforce，由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。4.DNA双螺旋的构象类型B-DNA：92%相对湿度，钠盐；接近细胞内的DNA构象，与Watson和Crick提出的模型相似。5.碱基在一条链上的排列顺序不受限制，但一旦确定后，即可决定另一条互补链上的序列。C-DNA：44~46%相对湿度。可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。D-DNA：60%相对湿度。E-DNA（三）DNA的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋、染色体包装A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似。Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。p489再次扭曲、螺旋（四）染色体包装的结构模型多级螺旋模型压缩倍数76405（8400）

DNA→核小体→螺线管→超螺线管→染色单体

2nm10nm30nm400nm2~10μm

一级包装二级包装三级包装四级包装

四、DNA与基因组织DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是指具有遗传效应的DNA片段或RNA，它能编码蛋白质或功能RNA。某些病毒的基因组是RNA。结构基因调节基因基因组（一）DNA与基因（二）原核生物基因组的特点1.DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。2.功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中（多顺反子）。3.有基因重叠现象。ABCDEFG（三）真核生物基因组的特点1.重复序列单拷贝序列：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。中度重复序列：在DNA中可重复几十次到几千次。高度重复序列：可重复几百万次高度重复序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体DNA更靠近管口；富含G-C的更靠近管底，称为卫星DNA（satelliteDNA）富含A-T富含G-C主体DNA2.有断裂基因mRNA1872bp内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。ABCDEG7700bpF外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。：由于基因中内含子的存在。例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferongene)没有内含子。transcription四、RNA的结构与功能——RNA分子高级结构是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。（一）tRNAtRNA约占RNA总量的15%，主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。tRNA分子量为4S，1965年Holley测定酵母tRNAAla一级结构，提出三叶草二级结构模型。倒L型三级结构主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TψC环含有T和ψ；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。RNA二级结构的通式：发夹结构或茎环结构（二）rRNA占细胞RNA总量的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。原核生物

真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S

90年代初，Noller证明23SrRNA具肽酰转移酶活性，蛋白质只是维持rRNA的构象。（三）mRNA与hnRNAmRNA约占细胞RNA总量的3~5%，是蛋白质合成的模板。真核生物mRNA的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的hnRNA。真核生物mRNA特点：5’端有帽子结构；3’端加polyA尾（四）snRNA和asRNAsnRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.1~1%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。asRNA可通过互补序列与特定的mRNA结合，抑制mRNA的翻译，还可抑制DNA的复制和转录。五、核酸的性质p503（一）一般理化性质1.为两性电解质，通常表现为酸性。2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。5.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。6.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。（二）核酸的紫外吸收性质p507核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。4.都溶于水不溶于有机溶剂如乙醇。——分离核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。

当A＝1时，DNA：50ug/ml，

RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。

纯DNA，A260/A280>=1.8<2.0

纯RNA，A260/A280>=2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。

<2.0

，>1.8，DNA很纯；>=2RNA很纯用A260/A280还可来表示核酸的纯度：核酸含量测定（三）核酸的变性：双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，变成单链，并不涉及共价键的断裂。DNA变性是个突变过程。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度(meltingtemperature,Tm)。TmTmDNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度

热变性因素酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后粘度降低，紫外吸收增加。二级结构改变，部分失活。

影响Tm的因素：（1）G-C的相对含量

（G+C）%=（Tm—69.3）×2.44（2）介质离子强度低，Tm低。（3）DNA均一性

均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围（五）核酸的复性（退火）：变性核酸的两条互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：（1）单链片段浓度（2）单链片段的大小（3）溶液离子强度的大小（越高越容易）（4）溶液温度的高低复性速度可用Co·t1/2

衡量（六）分子杂交p510：在退火条件下，不同来源的DNA互补形成双链，或DNA单链和RNA链的互补形成DNA-RNA杂合双链的过程。探针：一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列，用放射性同位素或荧光等标记。原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。六、核酸的序列测定p518目前多采用Sanger的酶法和Maxam-Gilbert的化学法OHOH2CHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤ddATPPPP原理：基本反应也是利用DNA聚合酶的酶促反应。反应体系包括模板DNA、引物、4种核苷酸和DNA聚合酶外，还加入一定比例的ddNTP，它随机的掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成终止，得到以ddNTP为结尾的不同大小片段。通过电泳直接读出DNA序列。小沟大沟主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3′端CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TψC环含有T和ψ；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。——CCGGTAGCAATT——3′5′模板引物——GG—5′3′GGCGGCCGGCCATCCddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAddATPAGGCCATCGGGCCATCGTTGGddGTPGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTTddTTPCCATCGTTGA5′3′1989年，第一种基因药物—重组αlb干扰素获准投放市场。至1999年，我国已有18种基因药物和疫苗获准进行商业化生产，另有26种基因药物处于临床前或临床Ⅰ、Ⅱ期试验，生物医药产业已初具规模。

1990年我国研制了第一例转基因家畜，1991年山羊克隆获得成功。

1993年我国第一例转基因作物抗病毒烟草进入了大田试验。

1997年第一例转基因耐储存番茄获准进行商品化生产，至1999年共有6种转基因作物产品投放市场。2000年我国转基因抗虫棉花种植面积超过550万亩。我国是人类基因组计划国际大协作的成员国，承担完成1%的任务。美、英、日、法、德、中科学家于2000年6月26日宣布人类基因组全部DNA序列的工作框架图已经完成。我国在国际上首先发现神经性耳聋的基因，基因治疗已有4个项目进入临床试验阶段。

生物芯片技术的开发研究与产业化正在与国际同步发展。染色体多级螺旋模型核酸水解p502酸水解：糖苷键比磷酸酯键易水解，嘌呤比嘧啶糖苷键易断裂。（最易是DNA的嘌呤糖苷键）碱水解：RNA易被碱水解（室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物）；DNA耐碱

酶水解

生物体内存在多种核酸水解酶

RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外切酶——从末端逐个切下核苷酸核酸内切酶：专一性水解某一特定核甘酸所形成的磷酸二酯键

最重要的：限制性核酸内切酶水解某一特定碱基序列

回文结构核酸含量测定p514-516一）紫外吸收法二）定磷法：9.5%三）定糖法：地衣酚

二苯胺

核酸纯度测定——最简单方法：紫外吸收法DNA的凝胶电泳——按分子大小来分离溴化乙锭EB荧光染色

DNA的分离p513DNP——溶于浓盐溶液1NNaCl，，但不溶于稀盐溶液0.14NNaCl浓盐溶液提取稀盐溶液沉淀苯酚抽提乙醇沉淀RNP——溶于稀盐溶液0.14NNaClRNase到处存在抽提要加酸性胍盐/苯酚/氯仿/RNase抑制剂/高温（器皿）SouthernBlotting