分子标记概述2003

DNA分子标记目录概述1.常用分子标记技术原理及操作2.几种分子标记方法比较3.分子标记在园艺植物中的应用4.1、基本概念遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段或者某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。是表示遗传多样性的有效手段，可以明确反映遗传多态性的生物特征。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体之间的遗传差异，是DNA水平遗传多态性的直接的反映常用遗传标记的类型细胞学标记生化标记分子标记3形态标记124广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子标记狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段DNA分子标记的优势直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多态性高遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的理想的分子标记具有高的多态性共显性遗传检测手段简单快速选择中性分子标记均匀分布于整个基因组能明确辨别等位基因遍布整个基因组成本低，重复性好以PCR为基础的分子标记技术例如SSR（1982）RAPD（1990）AP-PCR（1990）AFLP（1993）ISSR（1994）SAGE（1995）第二类分子标记以Southern杂交为基础的分子标记技术例如RFLP（1974）第一类分子标记以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术

例如SNP（1998）SRAP（2001）TRAP（2003）第三类分子标记DNA分子标记产生的分子基础PCR技术基因组DNA限制性内切酶引物DNA聚合酶带电荷的物质在电场中的趋向运动电泳核酸分子由于带负电荷，在电场中向阳极定向运动核酸电泳PCR反应步骤高温变性低温退火中温延伸使DNA双链解开让引物与单链模板互补结合以互补的引物为复制起点，dNPTs为原料，进行复制。

核酸电泳常用分子标记方法SSRRAPDSRAPISSRRFLPSNPRFLP标记法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间

原理

RFLP标记特点

遍布，无限不受外界环境、发育阶段、器官等影响探针多DNA需求量大，纯度高技术要求高，成本大RFLP标记基本步骤DNA杂交及放射自显影Southern印记转移琼脂糖凝胶电泳酶切DNA的分离

RAPD标记法（RandomAmplifiedPolymorphismDNA）以PCR技术为基础，以一系列人工合成的不同的随机排列顺序的寡聚核苷酸单链（通常为十聚体）为引物对所研究的基因组DNA进行PCR酶促体外扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色（或银染、放射自显影）来检验扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。原理RAPD标记特点试验步骤少没有物种特异性技术简便DNA样品量少存在共迁移问题重复性不高显现标记易发现多态性ADNA的提取B用随机引物对两个相对性状个体进行PCR扩增C用凝胶电泳分开产物DNA片段D查找特异的与目的性状共分离的DNA片段RAPD标记基本步骤SSR标记法（simplesequencerepeat）根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

原理SSR原理

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重复单元：1~6bp,如

CA,CTCG

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重复次数：5~30次

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覆盖长度：10~300bpSSR标记特点1.数量多且平均分布2.位于内含子中3.共显现遗传4.结果重复性高5.引物问题SSR标记的步骤TwoThreeOne构建小片段或大片段的基因组筛选阳性克隆测序、设计引物、优化PCR反应条件，获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳定、可靠的SSR标记。ISSR标记法（inter-simplesequencerepeat）在SSR的3’或5’端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基,引起特定位点退火,使引物与匹配SSR的一端结合,从而对基因组中特定片段进行扩增、检测,最后根据谱带的有无及相对位置分析不同样品间ISSR标记的多态性。原理

5’锚定引物3’锚定引物

NNNN（CA）n（CA）nNNCACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACA

NNn（CA）

（CA）nNNNN3’锚定引物5’锚定引物

3’锚定引物的PCR产物5’锚定引物的PCR产物ISSR标记特点FiveFourThreeTwoOne技术简单检测迅速，容易灵敏度高，特异性强具有高的多态性

稳定可靠，重复性好用6%的聚丙烯酰胺进行电泳分离，用EB或银染后放入可见光或紫外光下观察，统计带纹的有无及相对位置。在PCR仪上对基因组中的SSR间序列进行扩增。扩增步骤与RAPD技术相似,但不同引物、不同植物材料的扩增条件存在差异,需通过预备实验对体系反应加以设计可采用常规方取用于ISSR分析的DNA样品,如SDS法或CTAB法DNA提取PCR扩增电泳检测SRAP标记法（Sequence—relatedAmplifiedPolymorphism）

利用基因外显子里G、C含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放读码框架（ORFs）进行扩增。原理SRAP标记特点技术简单快速引物设计简单具高多态性信息量丰富在基因组中分布均匀稳定可靠重复性好ONETWOTHREEFOURSRAP标记的引物设计SRAP-PCR扩增凝胶电泳分析扩增产物检测与片段测序

SRAP标记的步骤SNP标记（SingleNucleotidePolymorphism）原理

单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等

不同生物个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特异PCR引物扩增和电泳检测显示出来。位点丰富、分布广泛具有更高的遗传稳定性，尤其是处于编码区的SNP检测快速、易于实现自动化分析富有代表性二态性和等位基因性SNP标记特点6种分子标记方法比较DNA质量要求DNA检测范围遗传特点多态性技术难度及重复性RFLP高低拷贝区共显性中等高、高RAPD低整个基因组显性较高中等、低SSR中高重复序列区共显性高低、高ISSR中高重复序列区显性高低、低SRAP低整个基因组共显性高低、低SNP高整个基因组共显性高高、高RFLP标记的应用

构建基因组遗传图谱及育种1

基因定位及基因突变分析

2

遗传多态性分析3

细胞质遗传研究4庄杰云等选用覆盖整个水稻遗传图谱的129和106个DNA探针,分别分析了汕稻品系IR54、5460、5460S之间和粳稻品系农垦58

、农垦58s及其育性回复突变系之间的RFLp。结果表明人工诱变能引起水稻染色体组各座位同时发生广泛的非致死性突变;自发突变较普遍,且多为回复突变。农垦58等3个粳稻品系之间的差异较小,但具有类似的趋势。应用举例RAPD标记的应用天然居群内及居群间的遗传变异种质资源搜集及品种鉴定种间或属间亲缘关系遗传图谱构建基因定位与分离等尹艳杰等利用RAPD标记分析了桂林市23个桂花品种的亲缘关系，研究表明，4个品种群内的不同品种间的亲缘关系接近，而不同品种群间亲缘关系较远。其中圆瓣金桂、桃叶金桂、湘金桂、金莲首先聚为一类，被命名为金桂品种群;南溪丹桂、贵妃红、籽丹桂、丹心被划分为丹桂品种群:四季桂、月月桂属于四季桂品种群，其余的品种，如紫粤、满天星、弄潮儿等都属于银桂品种群应用举例SSR标记的应用生物杂交育种及纯度鉴定01遗传连锁图谱02种群遗传多样性03系统发生等04应用举例

张敏等采用SSR标记技术，选用100对引物在鄂茄子2号亲本间进行PCR扩增．从中筛选出的3对引物SMl7、SM29、SM51在双亲本间能够扩增出差异互补的条带。利用这3对引物对鄂茄子2号杂种一代群体进行纯度鉴定，鉴定结果为97．1％；与同批次种子的田间鉴定结果(96．1％)接近，说明应用SSR分子标记技术实施茄子杂种一代种子的纯度鉴定是可行的．ISSR标记的应用群体遗传结构和遗传多样性研究遗传作图与基因定位品种和种质鉴定物种和种群亲缘关系研究品种纯度鉴定李严龙等将金叶女贞和平抗金叶女利用ISSR分子标记技术，鉴定发生变异的平抗金叶女贞品种。结果表明，平抗金叶女贞为金叶女贞品种在某一基因位点发生基因突变产生的单位点自然变异品种。应用举例SRAP标记的应用1

构建遗传图谱2

遗传多样性分析3

比较基因组学4

标定基因等杨建用RAP分子标记，以鹅掌楸种间杂交(BMxS)Fl代群体为材料，构建了一张鹅掌楸分子标记连锁遗传图。并