民院-检验核医学(放射免疫分析和免疫放射分析)

检验核医学第六章体外分析技术Invitroanalysistechniques概述

体外分析技术（invitroanalysistechniques）

1.广义地讲，是泛指以离体组织、血液或体液等作为生物样本，在人体外进行的、分析样本中成分或其含量的检测技术。以体外放射性核素标记配体（ligand）为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，在试管中进行的对微量生物活性物质进行定量分析的标记免疫分析技术。主要指放射免疫分析技术（radioimmunoassay,RIA）

2.主要检测放射性核素发射的γ射线量第一节放射免疫分析一、基本原理1.放射免疫分析（RIA）是利用放射性标记的抗原（*Ag）与非标记抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体（Ab）进行可逆性竞争性免疫结合反应。

*Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag+Ag

Ag-Ab+Ag*Ag和Ab量恒定2.标准曲线:利用一系列已知浓度的标准Ag(即标准品)与待测样品在相同条件下反应后，用放射计数仪测定*Ag–Ab(B)或游离的*Ag

（F）的放射性。以各浓度点测量的相应的放射性计数（cpm）或用计算参数[B/(B+F),B/F或B/B0]为纵坐标作图绘制标准曲线。a)Ab和*Ag

的量恒定

b)抗原抗体反应为可逆性

c)Ab和*Ag

的性质与结构相同特点

1.灵敏度高最小可测量为10-9-10-15g2.特异性强利用专一性强的结合反应

3.精确度好有效的质量控制方法

4.放射性不引入体内

5.所需待测样品少50-200l6.试剂药盒化，操作简便、快速

7.测量微机化，方便、快捷，客观、准确类型

竞争性体外放射分析

标记物结合剂

放射免疫分析*AgAb(RIA)

竞争蛋白结合分析*Ag血浆中固有的

(CPBA)激素载体蛋白

(TBG)

放射受体分析*LR(RRA)

放射酶分析*SE(REA)

非竞争性体外放射分析

免疫放射分析*Ab*Ab(IRMA)

受体的放射分析*LR(RBA)

酶的放射分析*SE(ERA)放射免疫分析(RIA)基本原理1RIA反应式分离剂*Ag+Ab

*Ag-Ab

*Ag-Ab

+分离剂

AgAg-Ab

Ag-Ab

1)一定量*Ag、不定量Ag与限量Ab进行竞争抑制结合反应2)*Ag-Ab

与Ag成负相关关系(反比)3)在实际工作中，用一系列已知浓度的Ag(标准品)进行实验制备剂量反应曲线(标准曲线，[*Ag-Ab]－[Ag]曲线)，未知样品在相同条件下实验，其浓度通过标准曲线查出2RIA数学函数式

k1Ag+Ab

Ag-Abk2P+QPQP=[Ag]+[*Ag]P0=[Ag0]+[*Ag0]Q=[Ab]Q0=[Ab0]PQ=[Ag-Ab]+[*Ag-Ab]k1[PQ][PQ]K=——=————=———————(1)k2[P][Q][P]([Q0]-[PQ])[PQ]=———————(2)([P0]-[PQ])[Q]

将B=

[PQ]/[P0]、B/F=B/(1-B)=[PQ]/[P]代入(1)B1K=———×———————(3)展开重排

1–B[Q0]-B[P0]

[Q0]1[Q0]

B2–B(1+———+———)+———=0(4)[P0]K[P0][P0]

将B=1-F代入(3)

[Q0]11

F2–F(1-———-———)+———=0(5)[P0]K[P0]K[P0]

定义R=B/F，由B+F=1得B=R/(1+R)代入(3)

R2+R(1+K[P0]–K[Q0])–K[Q0]=0(6)3RIA剂量反应曲线4方法流程

加样→温育→分离→测定→数据处理→签发检测报告基本试剂

1标准抗原(Ag)2标记抗原(*Ag)3抗血清(抗体，Ab)1标准抗原(Ag)

已知含量的非标记抗原用途(1)免疫动物，制备抗体

(2)制备标记抗原

(3)作为标准品参与RIA反应，绘制剂量反应曲线

要求(1)质量上高纯度与被测抗原属同一物质，具有相同的免疫(生物)活性，高度纯化

(2)数量上高准确度分一级标准(国家或国际标准)

二级标准(厂家或实验室标准)(3)稳定性好，便于贮存、运输和使用2抗血清(抗体，Ab)

含有抗体的血清质量指标(1)亲和力

(2)交叉反应率

(3)滴度(1)亲和力

Ab与Ag的结合能力，用亲和常数K表示

Scatchard作图法得：

B/F=K[Q0]–K[PQ]

为一直线

K=直线斜率

K>109L/mol(2)交叉反应率

Ab与Ag类似物的结合程度，表示Ab的特异性。分别用Ag和Ag类似物（Ag#）作剂量反应曲线

Ab与*Ag结合被抑制50%时[Ag]量交叉反应率=

Ab与*Ag结合

被抑制50%时[Ag#]量(3)滴度又称效价，反映与一定量

Ag特异结合的Ab的浓度,用稀释度表示用一定量标记Ag与不同稀释度的Ab反应，作B%-Ab稀释度曲线，B%=50%时对应的Ab稀释度即为Ab滴度,

合适的滴度为1:104-1063标记Ag

常用125I和3H标记化合物要求：

(1)适当高的放射性比活度影响方法的灵敏度和精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量

(2)放射化学纯度>95%影响方法的灵敏度

(3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致

(4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月标记Ag与Ab的用量对测定的影响

(1)待测Ag含量较高*Ag的比活度↓Ab的滴度↓灵敏度↓曲线范围↑

(2)待测Ag含量较低*Ag的比活度↑Ab的滴度↑灵敏度↑曲线范围↓分离技术1非特异性

(1)吸附法分离剂：葡聚糖凝胶包被活性炭(DCC)F被吸附沉淀，重复性差

(2)沉淀法分离剂：聚乙二醇(PEG)B被沉淀，分离迅速，非特异结合率高

(3)抽滤法常用滤膜：玻璃纤维滤膜、微孔滤膜

B与F的分子量差别明显时分离效果好2特异性分离方法

(1)双抗体法分离剂：第二抗体(抗抗体，Ab2)

分离时间长，非特异结合率低

(2)双抗体+PEG法分离迅速，非特异结合率低

(3)固相分离法固相材料包被Ab1、Ab2

固相材料：纤维素(包被珠)

试管(包被管)

磁化颗粒分析方法1反应方式(1)平衡加样法：标准(待测)Ag+Ab+标记

Ag→温育→分离→测定(2)顺序加样法：标准(待测)Ag+Ab→温育→+标记Ag→温育→分离→测定提高方法灵敏度的分析方法2反应介质

Tris-HCl或PB缓冲液，pH7.4-7.8

离子强度0.05-0.1M3反应温度和时间

K大，37ْC，1-3h；K小，4ْC，过夜4血样的采集与保存

(1)大都采用原样品(血清、血浆)，少数需经提取

(2)不及时分析的样品需分离出血清或血浆，-20ْC存放

(3)采样或反应时常用抗凝剂：EDTA-Na2，防腐剂：

NaN3，稳定剂：0.5%BSA、0.1%明胶、抑肽酶等RIA反应管类型

组类型基本反应试剂分离别名称常用符号AgAb*Ag试剂

总放射性管T--√-

标准非特异结合管N--√√

曲线组最大结合管B0(S0)-√√√

标准管Si√√√√

样品组样品管U√√√√

质控组质控管QC√√√√数据处理

1B%—D曲线

2B%—LogD

半对数反“S”曲线

3B/B0%—LogD

半对数反“S”曲线

4LogitB/B0—LogD

全对数直线

5四参数或五参数Logistic模型曲线

6四参数单位点质量作用模型曲线

RIA的质量控制质量控制的目的对分析工作中产生的误差进行检查和质量判断，对出现的质量异常现象寻找原因并采取纠正措施，以保证分析误差被控制在允许的范围内。杜绝过失误差，校正系统误差，控制随机误差。质量控制的内容(任务)1实验室内部质量控制(1)批内质控精密度评价偏差分析

(2)批间质控精密度评价偏差分析2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂或试剂盒进行综合评价

(2)对不同实验室的分析工作质量进行比较质量控制样品质控的“标准系统”－质控血清(QC)要求：1QC样品与待测样品性质相同

2QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致

3QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度

4足量制备，分装，低温存放，分批使用制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值

2在缓冲溶液中加入无待测物的蛋白质，再溶入三档浓度待测物标准品，测定标示值使用方法：QC样品组数＝√待测样品总数/3

以组为单位在待测样品中前、中、后放置测定质量控制指标1灵敏度能检测出与B0管具统计差别的最小可测量

(1)B0%-2SD的相应剂量(2)B0%-10%的相应剂量

(3)由精密度图得出2特异性抗体识别其抗原的能力，用交叉反应率表示3精密度在相同条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度，评价随机误差∑(Xi–X)2

|X1–X2|SD=———————n=2时，SD=—————n–1√24偏差测定值偏离真值的程度，评价系统误差准确度测定值与真值的符合程度，评价系统误差和随机误差测定值-真值偏差b=———————X100%

真值准确度=√偏差2+精密度2=√b2+SD25稳定性批间的重复性

B0%、NSB%、ED25、ED50、ED75、QC样品测定值6临床有效性一项分析方法完成临床目的的程度正常值及其范围、正常值与异常值交叉范围、诊断符合率(阳性率、阴性率、假阳性率、假阴性率)实验室内部质量控制方法1对实验数据进行审核剔除“坏点”2剂量反应曲线拟合及质量审核3精密度评价(1)反应误差关系RER

从多批实验资料求出直线方程式

SDR=a+bRa反映分离误差b反映加样误差(2)精密度图(P-P图)

(用剂量反应曲线)

通过RER将SDR转换SDD(CVD%)

作SDD(CVD%)-lgD曲线CVD%≤10%4偏差与准确度评价

(1)回收实验反映偏差测定值-空白值回收率%=—————X100%

已知值回收率%=100%±10%(2)健全性试验用标准品和样品分别作剂量反应曲线和样品稀释曲线，两条曲线应平行

(3)二样本-Youden图反映准确度，用QC样品

QC首-QC尾曲线，误差≤±2SD5稳定性评价批间质控，用QC样品

(1)Cusum图每批QC测定值与靶值的差累计后按批次连续作图，折线两端落差≤±5SD(2)质控图

QC测定值-批次曲线，误差≤±3SD评价

1三种浓度<2SD，双向（±

）或两种浓度<2SD，一种<3SD，双向正常

2三种浓度>2SD，但<3SD，双向或一种>3SD，双向随机误差大

3三种浓度中一种>3SD，两种>2SD，三种>1SD，单向（＋或－）系统误差大免疫放射分析(IRMA)基本原理1IRMA反应式

(1)单位点Ag+*Ab

↔Ag-*Ab+*Ab

SP-AgAg-*Ab+SP-Ag-*Ab

(2)双位点SP-Ab1+Ag↔SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2SP：表示固相2IRMA数学函数式

k1Ag+*Ab

Ag-*Abk2P+QPQP=[Ag]P0=[Ag0]Q=[*Ab]Q0=[*Ab0]PQ=[Ag-*Ab]=Bk1[PQ][PQ]K=—=———=——————————k2[P][Q]([P0]-[PQ])([Q0]-[PQ])B=————————展开重排

([P0]-B)([Q0]-B)

B2–B([P0]+[Q0]+1/K)+[P0][Q0]=03剂量反应曲线方法分类1双抗体夹心法（1）SP-Ab1+Ag↔SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（2）Ag+*Ab2

↔Ag-*Ab2+*Ab2

SP-Ab1SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（3）SP-Ab1+Ag+*Ab2

↔SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab22标记第三抗体

SP-Ab1+Ag+Ab2

SP-Ab1-Ag-Ab2

*Ab3

SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3*Ab3：第三抗体（抗抗体），为兔（豚鼠）抗小鼠IgG抗血清优点：通用性标记抗体3双标记抗体法*Ab2*Ab2SP-Ab1+AgSP-Ab1-AgSP-Ab1-Ag*Ab3*Ab3

优点：放射性比活度提高，就提高了方法的灵敏度和精密度影响免疫放射分析的主要因素1被测抗原的性质双位点IRMA要求被测抗原有两个以上的结合位点，方法局限于多肽和蛋白质抗原的分析2结合在固相抗体上的抗原稳定性被结合的抗原数量较多时，抗原从固相抗体上分离的倾向更明显高浓度的准确度较低浓度差3反应时间和温度室温或4˚C，24h；37˚C，1.5-3h4标记抗体的浓度标记抗体↑，测定范围↑，NSB↑5固相物的洗涤洗涤↓，CPM↑，洗涤↑，CPM↓6血清等的非特异性效应温度↑，血清效应↑IRMA反应管类型组类型基本反应试剂分离别名称常用符号Ag*Ab

试剂

总放射性管T-√-

标准非特异结合管N(S0)-√√

曲线组