对甘油制备1,3-丙二醇工艺进行设计

对甘油制备1,3-丙二醇工艺进行设计-发酵法制备1,3-丙二醇摘要：本设计以甘油为原料，在无氧条件下，利用克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇，符合绿色化学的特点。通过测定菌体生物量、葡萄糖浓度、蛋白质浓度、甘油脱水酶、丙醛的浓度，可以初步判定发酵进行程度。设计实验对克雷伯氏菌发酵特性进行研究，分别研究温度、PH、甘油初始浓度、氮源对菌体生长和1,3-PD合成的影响。关键词：1,3-丙二醇、甘油、克雷伯氏菌、厌氧发酵1前言1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料，它可作为化学和医药工业中多种润滑剂、有机溶剂和前体的合成原料。它作为聚酯、聚醚和聚氨酯的重要单体原料合成的聚合物具有生物可降解性、安全无毒、可循环利用等优点，不仅在服装和工程塑料领域得到了广泛应用，在食品、药品和化妆品等领域也开始崭露头角。以1,3-丙二醇为原料合成的食品添加剂丙二醇酯，是世界六大食品乳化剂之一，目前已被美国、日本和中国等国家及欧盟，联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用。20世纪90年代中期,工业上成功开发出了以1,3-PD为原料的新型聚酯材料-聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT),PTT性能优良,因此研究开发低成本的1,3-PD生产技术成为关注的热点。1,3-PD的生产方法有化学法和生物转化法。生物法合成1,3-PD符合“绿色化学”的特点，利用甘油或葡萄糖等可再生资源为原料，生产清洁，对环境无污染，符合我国可持续发展的需要。近几年，随着以大豆油与菜籽油为原料生产生物柴油产量的迅速增长，产生了大量副产物甘油；用甘油合成附加值更高的1,3-丙二醇有利于资源的综合利用，引起了如杜邦公司、陶氏化学公司、亨斯迈公司等公司的关注。发酵工程作为生物法合成1,3-PD的关键环节更是人们关注的热点。2003年美国环境保护机构向杜邦授予“绿色化学总统奖”，专门用于表彰该公司对生物基1,3-PD工艺开发所作的研究。21,3-丙二醇(1,3-PD)的概述2.11,3-丙二醇(1,3-PD)的基本性质1,3-丙二醇(1,3-PD)无色无味，易溶于水、乙醇和多种有机溶剂，微溶于氯仿和甲苯，是一种重要的化工原料。与其它二元醇相比，1,3-PD具有更高的沸点和更低的熔点（见表1-1）。表1-11,3-丙二醇与其他二醇的性质比较性质乙二醇1,2-丙二醇1,3-丙二醇熔点（℃）8.5-59-27沸点（℃）116118216密度（）08981.0361.060其化学性质体现了醇和二元醇的典型性质可与羧酸缩合成酯，与异腈酸盐及酸性氯化物反应生成聚氨酯，与二元酸反应生成聚酯。由1,3-PD制得的聚合物易于生物降解，对环境友好。关于1,3-PD的生物毒害作用，早期报道1,3-PD对哺乳动物具有低水平的毒性，大鼠LD50大约是10g/kg，兔子LD50大约是4.2g/kg。但是最近Gingell对大鼠的研究表明，长期的1,3-PD摄入（1000mg/kg·day）并没有对大鼠产生毒害作。2.21,3-丙二醇的主要用途1,3-PD由于其对称性的三碳结构被用作许多化合物和聚合物的合成，可用于食品、化妆品和制药等行业，也可用于抗冻剂、增塑剂、乳化剂等的合成原料。（1）作为中间体用于食品、化妆品和制药等领域。以1,3-PD为原料合成的丙二醇酯是一类食品添加剂，其作为世界六大食品乳化剂之一，目前已被美国，日大等国家及联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用。由1,3-丙二醇合成的聚合物由于具有生物可降解性、安全无毒以及耐油、耐老化等许多其它二元醇合成塑料所不具有的优良特性，在食品包装材料具有广泛的应用前景。以1,3-PD为基础合成的2-氨基-1,3-丙二醇及其衍生物可以预防或治愈移植接受者的急性或慢性排斥反应，并可预防或治愈由于移植引发的血管疾病。非氨酯中间体2-苯基-1,3-丙二醇作为新一代抗癫痫药，也正得到越来越多的应用。（2）作为单体用于合成聚酯、聚氨酯等聚酯材料。以1,3-PD为单体合成的聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）由于具有回弹性好、易染色等比聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）等合成纤维更优良的特性，在地毯、服装面料、工程塑料和薄膜制造方面均有较好的应用前景1998年，PTT被美国评为六大石化新品之一。作为二元醇，1,3-PD还能代替1,4-丁二醇和新戊二醇作为中间体，近来美国ChemSystems公司研究发现1,3-PD的二醇官能团使其用于聚氨酯的生产具有很大潜力，可用于聚酯多元醇的生产和链增长剂。2.31,3-丙二醇的生产概况早在1948年,美国Shell公司就申请了以丙烯醛水合路线合成1,3-PD的专利，并于20世纪70年代实施了产业化。90年代中期荷兰壳牌公司首先实现PTT商品化,商品名为Corterra,并开发了化学法生产1,3-PD的新工艺路线,年产量4,000ｔ从此激起全球PTT开发热潮。而后，年产72,000t的装置已于1999年12月在路易斯安那Geismar投入运营。德国Degussa公司1995年宣布已成功地开发出以丙烯醛为原料合成1,3-PD的新工艺，其成本与乙二醇大致相当，并在比利时的Antwerp建成2000t/a中试装置。1996年又建设了5万t/a工业生产装置，其产品用于生产新型聚酯纤维PTT和聚酯涂料。1998年美国杜邦公司从Degussa公司获得了化学法生产技术,但杜邦公司并不把化学法作为生产1,3-PD的主要方向,而倾向于用经济可行的生物转化法进行生产,与世界第二大工业酶生产商Genencor国际有限公司申请了以可发酵碳源为底物用基因工程菌直接生产1,3-PD的专利基于这一创新，2003年美国环境保护机构向杜邦授予“绿色化学总统奖”，专门用于表彰公司对生物基1,3-PD工艺开发所作的研究2004年6月20日，杜邦公司最新推出的以1,3-PD为主要原料生产的最先进的高分子聚合物Sorona®。杜邦已宣布，将从2006年开始通过使用生物基1,3-PD来生产Sorona®，即所采用的1,3-PD将是用玉米糖发酵的生物技术而制备的。根据2006年7月4日ICIS报告显示，Dupont公司与英国Tate&Lyle公司合作建成以玉米葡糖为原料年产45Kt/a的发酵法生产1,3-PD装置，已在美国田纳西州洛顿市试运行。2.41,3-丙二醇的合成方法2.4.1环氧乙烷法生产1,3-丙二醇环氧乙烷法是荷兰壳牌(Shell)等公司开发的一种新方法。该法包括两步反应，环氧乙烷（简称EO）首先与CO和氢气进行氢甲酰化反应生成3-羟基丙醛，后者再在一个固定床催化剂上7.5MPa～15MPa和100℃～200℃下加氢制得1,3-PD。总反应式如下：EO＋CO＋2H2→1,3-PD。该工艺的特点是技术难度大，装置投资高，但产品的质量和成本有竞争力。2.4.2丙烯醛水合加氢法1,3-丙二醇丙烯醛法是Degussa公司开发的方法，也包括两步反应。第一步是在未透露的酸催化剂存在下，丙烯醛水合为3-羟基丙醛；第二步反应实际与环氧乙烷法的第二步反应相同。反应式如下：第一步：丙烯醛水合为3-羟基丙醛CH2=CHCHO+H2O→HOCH2CH2CHO第二步：3-HPA催化加氢制得1,3-PDHOCH2CH2CHO+H2→HOCH2CH2CH2OH丙烯醛路线反应条件比较温和，技术难度也不大。但丙烯醛本身也是一种重要的有机中间体，而且属剧毒易燃易爆物品，难以储存和运输。2.4.3生物法合成1,3-丙二醇自1881年AuhustFreund发现巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)能够利用甘油合成1,3-PD以来，至今已发现多种微生物具有在厌氧或兼性厌氧条件下合成1,3-PD的能力，包括：克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)以及絮凝长杆菌（Enterobacteragglomerans）、乳杆菌属的短乳杆菌（Lactobacillibrevis）和布氏乳杆菌(Lactobacillibuchneri)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiabutyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridiapasteuianu)等，其中克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、弗氏柠檬菌因具有较高的1,3-PD转化率及生产强度，是研究的最多的三种菌。3材料与方法3.1材料3.1.1菌种实验所用1,3-PD转化菌KlebsiellapneumoniaeXJPD-Li从新疆特殊环境土样中筛选得到,由石河子大学兵团化工绿色过程重点实验室。3.1.2试剂酵母浸膏、碳酸钙、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、氯化钴、氯化锰、氯化锌、硼酸、钼酸钠、氯化镍、氯化铜、氯化铵、氯化钾、硫酸钠、氯化镁、氯化铁、氯化钙、柠檬酸、氯化钠、氢氧化钠、甘油、辅酶I、1,4一二硫代苏糖醇、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、1，2一丙二醇、柠檬酸钾、盐酸3一甲基一2苯并噻唑酮腙(MBTH)、维生素B12。3.1.3培养基(1)固体培养基（）：LB培养基，用于菌种保藏及活化。牛肉膏10，蛋白胨10，NaCl5，琼脂17，pH7.0。(2)限制性培养基（）：用于菌株驯化。甘油20，硫酸铵6，NaCl1，pH7.0。(3)发酵（种子）培养基（）：见表2－1表2-1发酵（种子）培养基组成组分成分发酵培养基（）磷酸氢二钾5.1磷酸二氢钾1.5硫酸铵6.0硫酸镁0.2氯化钙0.02酵母粉1.0甘油20.0微量元素1.0铁溶液2.03.1.4主要仪器与设备分光光度计721型、电热恒温鼓风干燥箱VIS一9140A、828型ThermoOrionpH计、电子天平CBP190S、超声波细胞破碎仪UP50H、高速冷冻离心机3K30、4kl5超速低温冷冻离心机、联机紫外可见光分光光度计UV-2401(PC)S以及恒温水浴装置TB．85、DZX．40立式电热灭菌锅、HYG．II旋转式恒温摇床柜、Spectrum756型紫外可见光分光光度计、HQ--60漩涡混合器。3.2实验方法3.2.1摇瓶培养1）斜面培养：40℃恒温培养箱培养，时间12h。2）微好氧种子培养：从活化的斜面上挑取菌苔，接入装液量为50mL的150mL普通三角瓶，40℃水浴摇床培养12h，摇床转速150rpm。3）发酵培养。厌氧培养：300ml厌氧培养摇瓶（图2-1），装液量100ml，接种量5%，40℃恒温水浴摇床培养，转速120rpm，通入氮气维持厌氧，通气量0.2vvm。根据情况在培养4h、8h、12h补加一定量的甘油和碱，每隔一定时间取样测定代谢产物和酶活变化情况。微好氧氧培养：厌氧培养摇瓶通入空气，通气比0.2vvm，其余条件同厌氧培养。3.3分析方法3.3.1菌体生物量的测定干重法测定菌体浓度：菌体浓度定义为单位体积菌液中所含菌体经烘干至恒重时的重量，单位为g/L。取1.5mL小离心管置于80℃恒温烘箱中烘干，在电子天平（1/10000）上准确称重，记录为离心管初重。将发酵液充分摇匀，取1.0mL加入已称重的离心管中，在5000rpm离心转速下离心10min，弃去上清液，置于80℃烘箱中烘干至恒重，在电子天平上再次称离心管重量，记为末重。末重与初重之差即为1mL发酵液中所含菌体细胞干重。菌体浓度（g/L）=菌体细胞干重/发酵液体积。浊度法测定菌体浓度：实验中菌体浓度是通过测定菌液在650nm波长下的吸光度反映的。取一定量的菌液稀释适当的倍数，将稀释的菌液置于玻璃比色皿中，以去离子水为参比，迅速测定其在650nm波长下的吸光度。实际菌体浓度=菌体浓度测定值×稀释倍数。3.3.2葡萄糖浓度的测定葡萄糖浓度由SBA－40C生物传感分析仪直接测定。SBA－40C生物传感分析仪利用酶促反应来定量，样品分析的工作原理如下：样品经离心去除菌体后稀释25倍，定量进样针吸取样品25μl，注入反应池。含有葡萄糖的样品在样品池内迅速按一定比例混合均匀。葡萄糖透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应，反应放出的再透过酶膜圈的内层与白金－银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度呈线性比例关系，经微机控制的信号可以直接显示结果。3.3.3蛋白质浓度的测定蛋白质定量采用考马斯亮蓝法，牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。原理：考马斯亮蓝法是利用蛋白质和染料结合的原理定量测定蛋白质浓度。考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使得染料的最大吸收峰位置由465nm变为595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量与标准曲线对照即可知与其结合蛋白质的量。考马斯亮蓝溶液：取100mg考马斯亮蓝G-250染料溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%的磷酸溶液，用蒸馏水稀释至1000ml。蛋白标准储液(1g/L)：用生理盐水溶解牛血清白蛋白制成，冰箱保存。3.3.4丙醛浓度的测定丙醛是根据其与3-甲基－2－苯并咪唑腙（MBTH）显色后在305nm处具有特征吸收峰测定的。配置不同浓度丙醛，取1mL与0.5mL0.1％的MBTH显色15min后加入2mL蒸馏水稀释，然后测定，丙醛浓度与的关系见图2-2。图2-2丙醛标准溶液3.3.5甘油脱水酶（GDHt）的测定甘油脱水酶（GDHt）活性的测定采用Toraya建立的MBTH方法，且根据酶的反应特征做了部分修订。反应原理如下：样品预处理：取一定体积菌液离心处理，沉淀用50mmol/L的缓冲液(pH8.0)充分洗涤后离心，倒掉上清液，用缓冲液重悬沉淀，超声破碎（3s×3s×90次）后离心，上清液即为粗酶液，所有离心条件均为10000r/min,3min,4℃。反应体系3.5ml，其中含有0.1mlKCl(0.05mol/L))，0.1ml1,2-丙二醇(0.2mol/L)，0.1ml辅酶B12(15μmol/L)，0.7ml酶液(空白样品加0.7ml缓冲液)；加入酶液开始计时，40℃反应10min后加入1ml0.1mol/L的柠檬酸钾中止反应，加入0.5ml0.1%MBTH显色15min，再加入1ml蒸馏水稀释在305nm波长下测定其吸光度。酶活定义：一个酶活单位定义为在上述条件下催化形成1μmol丙醛所需的酶量，比酶活为每毫克蛋白的酶活。相对酶活为酶活与最大酶活的比值，用百分数表示。3.4原料甘油的选择采用纯甘油、粗发酵甘油、低纯度皂化甘油进行摇瓶发酵实验,以确定不同原料对菌体生长和产物1,3-丙二醇生成的影响程度。菌体生长情况可由OD值反映,通过摇瓶发酵实验，并测定生物量，根据测定的数值就可以分析这三种甘油的发酵效果。3.5克雷伯氏菌发酵特性的研究3.5.1温度对菌体生长和1,3-PD合成的影响在目前报道的1,3-PD合成微生物中，Clostridiumpasteurianum的最适发酵温度为30℃，Clostridiumbutyricum的为35℃，而的最适生长和发酵温度均介于30℃到37℃之间。因此，设置28℃-45℃克雷伯氏菌的温度梯度厌氧发酵12小时后检测菌体生物量、甘油转化率和1,3-PD产量与生产强度,然后根据测定数值就可以得出克雷伯氏菌发酵的最佳温度。3.5.2pH对菌体生长和1,3-PD合成的影响微生物生长过程中机体内发生的绝大多数反应是酶促反应，pH通过影响细胞质膜的透性、物质的溶解性等方面影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长和代谢。在甘油厌氧代谢过程中，微生物会产生一定的乳酸、乙酸、丁酸等副产物使培养基pH降低，利用磷酸钾缓冲溶液调节基础发酵培养基pH值，40℃发酵12小时，考察pH值变化对菌体生长与产物的合成的影响，从而确定最佳的发酵PH。同时，实际生产中要不断地补充缓冲液调节体系的PH值，使其保持在最佳的条件下进行。3.5.3甘油初始浓度对菌的生长和1,3-PD合成的影响甘油作为发酵法生产1,3-PD的底物是微生物生长、产物合成和副产物形成等的反应物，其初始浓度的大小对1,3-PD的合成有很大影响。在基础发酵培养基的基础上，分别选择甘油为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的浓度梯度，考察甘油浓度对克雷伯氏菌的生长和1,3-PD合成的影响。3.5.4氮源对菌体生长和1,3-PD合成的影响常见有机氮源中酵母浸粉最有利于克雷伯氏菌的生长代谢，而无机氮源对其生长和发酵结果有较大影响。故选择含氮量分别为0.045mol/l的无机氮源研究克雷伯氏菌对不同氮源的利用情况。在培养基初始pH为8.0，发酵温度为40℃，20g/L的甘油下培养12小时后，菌体生物量和产物1,3-PD的积累。4结论根据实验结果，分析不同原料对克雷伯氏菌的生长和产物的合成影响，得到最佳的合成原料。同时分析温度、PH、甘油浓度、氮源对克雷伯氏菌的生长和产物的合成影响，确定最佳的生产工艺。参考文献：[1]饶兴鹤.全球丙二醇生产现状及其需求前景.中国石油和化工经济分析,2006,15:52-53[2]陶氏用可再生原料生产丙二醇.中国工业生物信息网，每周快报（第十八期）./info/view/4866.2007[3]ShellChemicalCompany.Acutetoxicity,skinandeyeirritation,andskinsensitizingpotentialoftrimethyleneglycol.Inproprietaryreport:Toxicologyofthechemicals.Sittingbourne,Kent,UnitedKingdom,1977[4]GingellR.,Kirkpatrick.J.B.,andSteup.D.R.SubchronicToxicityStudyof1,3-propanediolAdministeredOrallytoRats.Inter.J.Toxicol.,2000,19:27-32[5]张灿，张惠斌，黄海燕等.非氨酯中间体2-苯基-1，3-丙二醇的合成.中国医药工业杂志，1996,10:468[6]王剑锋，刘海军，修志龙，范圣第.生物转化生产1,3-丙二醇的研究进展.化学通报,2001,10:621-625[7]Toraya,T.,S.Kuno,S.Fukui,DistributionofcoenzymeB12-dependentdioldehydrataseandglyceroldehy