PCR的种类及应用

PCR的种类及应用

序2023/2/41

PCR的历史操作过程引物步骤

PCR的各种变体PCR的应用鉴定基因亲子鉴定诊断遗传病克隆基因诱变分析远古DNA鉴定特定表型的突变体基因比较基因表达量

目录2023/2/43PCR这项技术是由凯利·穆利斯(KaryMullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。PCR历史2023/2/4DNA的复制DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leadingstrand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(laggingstrand)。2023/2/45

①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性：切除受损伤的DNA，可用于切口平移（nicktranslation).

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermusaquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.TaqDNA聚合酶2023/2/47PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。它可以在试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称为无细胞的分子克隆法。PCR的定义PCR操作过程1、预变性（Initialdenaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。2、引物退火（Primerannealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特炖条带6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。引物设计设计引物可以采取以下原则：GC所占比例为40％－60％两个引物的Tm，相差小于5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。内部的具有自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。3‘末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。倒数第二个最好是G/CPCR的各种变体反向PCR(InversePCR,IPCR)不对称PCR(asymmetricPCR)多重PCR荧光定量PCR（Q-PCR)反转录PCR(reversetranscription,RT-PCR)

巢式PCR(NESTPCR)递减PCR(TouchdownPCR)2023/2/410原理：扩增引物相反方向DNA

序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

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已知序列未知序列反向PCR(InversePCR,IPCR)1.用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶消化大分子量的DNA

2.产生的大小不同的线性DNA片段群体，其中具靶DNA区段的DNA分子长度不超过2-3Kb,经连接后环化成环状分子3.按靶序列设计的一对向外引物同靶序列5，--端互补序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指4.经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制酶的识别位点2023/2/412应用：

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。

应用于染色体步移、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。局限性：

需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。2023/2/413

就像任何DNA一样，PCR的双链DNA产物也可以供序列测定使用。然而，按照Sanger双脱氧末端链终止法测定DNA的核苷酸序列，最好是使用单链模版DNA。现在已经发展出了一种专门用于制备单链DNA的技术—不对称PCR技术。

这种技术，除了使用的两种引物浓度相差100倍以外，其他的方面跟常规PCR技术没有什么本质的区别。

不对称PCR

2023/2/414基本原理：

PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的1%（或2%）。经过PCR循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继续引导DNA合成。这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。2023/2/415不对称PCR的原理多重PCR

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同

多重PCR的试验步骤

同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。

1.DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。

2.DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。

3.多重PCR扩增：反应体系可以选定为20μl，50μl等，反应体系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，TaqDNA聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，多重PCR技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于检测扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。

4.电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlE、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。

多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。1）多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.

2）某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.

应用荧光定量PCR(Q-PCR)

Q-PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

将模板稀释成一系列的浓度梯度进行PCR反应，用个这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品或未知浓度的样品。用模版初始量的log值对每个稀释样品的Ct值作图，两者称递减的线性关系，称之为标准曲线。作标准曲线用来评定反应条件的优化（保证样本有准确可重复的实验结果）

Q-PCR

荧光化学方法1）DNA结合燃料（SYBRGreen1）SYBRGreen1是荧光定量PCR最常用的DNA结合燃料，与dsDNA非特异性结合。在游离的状态下，SYBRGreen1发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合，荧光强度增加1000倍。

缺乏特异性；不能用于多重反应，因为不能区分不同扩增子发出的荧光，用于单重实验。2）荧光燃料标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针（TaqMan和分子信标）TaqMan实验主要优点：高特异性、高信噪比和能进行多重反应。

缺点：探针的初始成本比较高和实验设计比较繁琐。

荧光报告基团的种类：FAM(发绿色荧光)、HEX、TAMRA、Texas

Red和Cy5等

分子信标（molecularbeacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。Q-PCR的应用（1）荧光定量PCR数据分析，绝对定量和相对定量。生物学家通常对下列事情感兴趣：a)给定的血样中的病毒颗粒数；b)相当量的肿瘤组织和正常组织比，p53mRNA改变了多少倍。（2）基因表达差异分析。

例如：与一个生物合成途径有关的三个基因（A、B、C），选择内参基因为β-actin，在两个样本（a、b）中的相对表达情况。用TaqMan探针进行多重实验扩增分析基因表达差异（3）基因型/等位基因分析，例如SNP检测等（4）转基因生物检测，比如可以准确的检测食品中某一种转基因成分的含量。其实就是跟野生型生物相比该基因表达量RT-PCR

RT-PCR有很高的敏感性，可以用来分析不同组织，或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性。2023/2/424巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。TouchdownPCR用来避免非特异性序列的扩增PCR中引物的黏合温度(annealingtemperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可