动物细胞融合()

设计型实验（二）

动物细胞融合

组员：王勇、邓代进、田维、杜星志动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动受精作用两个细胞正在融合动物细胞融合基本过程：诱导方法：诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活的病毒电刺激聚乙二醇PEG聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。聚乙二醇PEG诱导融合实验原理：

利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响：PEG的分子量与浓度:

细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2.PEG的pH值:

经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3.PEG的处理时间:

处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4.融合时的温度:

由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞,一般采用的温度为38~40℃。

而本次试验基本在37℃的条件下进行。实验选材：本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材料,这是因为:1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。实验步骤：取新鲜鸡血,制成体积分数10%鸡红细胞悬液。称0.5gPEG(MW=4000)，熔化。尽快加入0.5ml预热80℃的Hanks

液，制成质量分数50%PEG，轻轻摇匀，散温，置37℃恒温水浴箱中备用（以防冷却后会形成结晶）。吸取1mL

悬液置刻度离心管中,另加5mLHanks液,混匀,离心（1000r/min）5min

。吸取0.5mlPEG加入鸡红细胞沉淀管内，1min内加入离心管中，边滴边摇晃（此过程必须在37℃水浴箱中进行）。静置1min后，加入9mlHanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴箱中放置10min。吸弃上清液，使沉淀物松散，置37℃水浴箱中维持。离心（1000r/min）5min,吸弃上清液，加入1ml不含血清的1640培养液，混匀后取1滴悬液制成临时装片。用质量分数为0.12%的次甲基蓝染色。镜检。离心（1000r/min）5min,吸弃上清液，加入3ml含小牛血清的1640培养液，轻轻吹打混匀，置37℃水浴箱中温育30min。注意事项：1、注意PEG浓度和作用时间等，即在制备鸡红细胞沉淀物时，一定不要有残留的液体存在，并且要在37℃水浴锅中于15min内全部滴完PEG，这样融合的效果最好；2、制备50%PEG完后，需置于37℃恒温水浴箱中备用，以防冷却后会形成结晶；讨论：经过小组成员内部讨论和查阅资料，我们对细胞融合实验的选材有了补充：我们也可以用蟾蜍血红细胞进行这项实验，并且蟾蜍血红细胞也易取得。同时也可做蟾蜍血红细胞与鸡血红细胞的融合实验，但实验试剂需要改变：1、Alsver液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，氯化钠0.42g，加重蒸水至100mL即可。4、Ringer溶液：二氯化钠0.25g，氯化钾0.42g,氯化钠6.5g,溶于1000mL重蒸水中。3、GKN液：氯化钠8g,氯化钾0.4g,磷酸氢二钠1.77g,磷酸二氢钠0.69g,葡萄糖2g，酚红0.01g,溶于1000mL重蒸水中。2、0.85%生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL重蒸水中。5、50%PEG混合液：称取少许PEG（Mv=4000）放入刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50℃时，放入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。（注意使用前配置）

但从上述过程看来，实际配制过程较为繁琐，因此，我们还是选择鸡血红细胞进行实验。细胞核的分离和鉴定

实验原理

一、分离细胞质与细胞核

１.破碎细胞细胞破碎的方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分级分离出来(cellfractionation)。２.离心技术组织细胞匀浆分级分离分析离心方法差速沉降离心法

速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法

差速离心法differentialcentrifugation原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。加速低速高速差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。

二、细胞核的鉴定本次试验细胞选择的是小白鼠的肝细胞，这是因为肝细胞分裂旺盛。鉴定试剂：甲苯胺蓝细胞来源：

甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为碱性染料,因此可以和组织细胞的酸性物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。

实验步骤：1、颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。2、称取湿重约1g的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。3、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆（匀浆器下段浸入盛有冰块的小烧杯中保持低温），捣毁组织，直至看不到明显的组织块。4、匀浆彻底后，8层纱布过滤（先用少量匀浆缓冲液润湿纱布），滤液转移至玻璃离心管中。5、平衡离心管，离心10min(2500r/min),将上清移入另一玻璃离心管中。取上清液制一张