酶和细胞固定化详解演示文稿

酶和细胞固定化详解演示文稿第一页，共四十二页。优选酶和细胞固定化第二页，共四十二页。1、固定化酶的定义2、酶的固定化方法3、固定化酶的特点GoGoGo4、固定化酶的评价Go第三页，共四十二页。7.1固定化酶的定义水溶性酶水不溶性载体固相酶（水不溶性酶）固定化技术第四页，共四十二页。

固定化酶(enzymeimmobilization):是指固定在一定的载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。形式：酶柱—连续生产反应器—批式搅拌反应酶膜、酶管—分析化学微胶囊酶—治疗酶

第五页，共四十二页。几点要求:

（酶的固定化）

保持酶的催化活性和专一性固定化酶可回收及多次使用酶固定化后产生的位阻要小固定化酶的成本尽可能低，以利用于工业化生产使用第六页，共四十二页。7.2酶固定化方法第七页，共四十二页。通过氢键、疏水作用、离子键等物理作用，将酶或含酶菌体吸附在水不溶载体表面的方法。是酶固定化最简单的方法

1、吸附法(absorptionmethod)第八页，共四十二页。（1）物理吸附法酶与载体之间的亲和力：范德华力、氢键、疏水作用常用的载体：有机载体和无机载体

有机载体：纤维素、淀粉、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铝、硅藻土、微孔玻璃无机载体吸附容量低，一般在每克载体吸附1mg蛋白。有机载体吸附容量高一些，火棉胶吸附木瓜蛋白，吸附容量每平方厘米膜70mg蛋白。第九页，共四十二页。特点：载体来源广泛、操作简单、对酶的活性中心和高级结构影响少

。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制第十页，共四十二页。（2）离子吸附法酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶载体的固定方法。常用的载体

阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）—纤维素、

DEAE—葡聚糖凝胶阳离子交换剂：CM-纤维素、纤维素柠檬酸盐离子吸附容量一般大于物理吸附容量，50-150mg蛋白/g载体第十一页，共四十二页。将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法多孔载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、明胶

2、包埋法(entrapmentmethod)第十二页，共四十二页。优点：方法简单，酶分子仅仅被包裹，未受到化学反应，酶活力回收力高。缺点：只适合作用于小分子底物的酶，不适合作用于大分子底物的酶根据载体材料和方法不同分为：凝胶包埋法半透膜包埋法第十三页，共四十二页。将酶或含酶菌体包埋交联的水不溶凝胶格子的包埋方法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。

1）凝胶包埋法第十四页，共四十二页。海藻酸钙凝胶包埋法将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。操作简单、条件温和，对细胞无毒。第十五页，共四十二页。●将酶包埋于具有半透性聚合物膜内的固定化方法。

半透膜的孔径小于酶分子的直径，可以防止酶与膜外环境直接接触，增强酶的稳定性。●常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。

2）半透膜包埋法第十六页，共四十二页。酶分子与载体之间以共价键作用而实现结合的固定方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。3、共价结合法(combinemethod)第十七页，共四十二页。载体的要求选择亲水性载体载体结构松散、表面积大、一定的机械强度载体要有在温和条件下与酶共价结合的功能基团载体没有或少有非专一性吸附载体来源容易、可反复使用第十八页，共四十二页。载体的选择

载体结构疏松、表面积大、机械强度载体有与酶共价的功能基团载体吸附功能有一定的专一性载体来源广、价格廉价、重复使用第十九页，共四十二页。酶蛋白上可供载体结合的基团酶蛋白N端氨基或赖氨酸的ε-氨基酶蛋白C端的羧基以及天冬氨酸和谷氨酸的r-羧基半胱氨酸的巯基丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸-羟基组氨酸-咪唑基苯丙氨酸、酪氨酸—苯环色氨酸的吲跺基r第二十页，共四十二页。酶分子可以形成的共价键基团氨基、羧基、巯基、咪唑基常用的载体活化与偶联反应：重氮反应、叠氮反应、溴化氮法、烷化法第二十一页，共四十二页。第二十二页，共四十二页。借助双功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间发生交联作用，形成网状结构的固定化酶的方法。4、交联法(crosslinkingmethod)第二十三页，共四十二页。常用的双功能试剂戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐其中常用的是戊二醛交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，但由于交联反应条件较激烈，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。第二十四页，共四十二页。共价交联法的四种形式：（1）酶直接交联法（2）酶辅助蛋白交联（4）载体交联法（3）吸附交联法第二十五页，共四十二页。借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。

固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，固定化的重现性较差，活力回收往往不高。（1）酶直接交联法：第二十六页，共四十二页。举例：酶直接交联法—固定化酶木瓜蛋白酶0.2℅酶蛋白浓度、2.3℅戊二醛、pH5.2~7.2、0℃交联24小时，可形成固定化酶。随pH升高，固定化速度增加pH低于4不能形成固定化酶有人认为pH控制在酶的等电点附近有利于固定化第二十七页，共四十二页。

酶分子在双功能试剂或多功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶的载体之间发生交联的酶固定法。当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，可使酶与惰性蛋白共交联。常用的载体蛋白：牛血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、血红蛋白等。举例：利用卵清固定化木瓜蛋白酶

（2）酶辅助蛋白交联：第二十八页，共四十二页。此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（3）吸附交联法：第二十九页，共四十二页。用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。

（4）载体交联法：第三十页，共四十二页。5、四种固定化酶制备方法的特点小结物理吸附包埋法共价结合法共价交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中高中制法特性第三十一页，共四十二页。7.2固定化酶的特性：固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。固定化酶的最适温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。

第三十二页，共四十二页。（一）影响固定化酶（细胞）性质的因素

酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：

分配效应

空间障碍效应扩散限制效应第三十三页，共四十二页。由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。

1、分配效应第三十四页，共四十二页。固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，影响酶分子的活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。

2、空间障碍效应第三十五页，共四十二页。第三十六页，共四十二页。

酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：

1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。

2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。

3、扩散限制效应第三十七页，共四十二页。7.3固定化酶的评价1、固定化酶的活力测定间歇测定连续测