第7章 RNA遗传 - 副本

分子遗传学

MolecularGenetics

第7章RNA遗传

中国医科大学

医学遗传学教研室

李福才

2013.3

1第7章RNA遗传

7.1RNA世界——生命早期的遗传物质

7.2RNA干涉/干扰现象

7.3RNAi对基因表达的作用

7.4RNA编辑RNA遗传在中心法则中，RNA只是作为一个中间环节被描述，真正的遗传模板是DNA。但是，20世纪70年代发现反转录酶以后，在Crick修正后的中心法则中，可以看到RNA已不是过去的中间环节，而是具有与DNA同等地位的遗传模板。

然而，RNA编辑、RNA干扰的发现与研究，更使我们对RNA的遗传作用刮目相看。

著名的分子生物学家Pennisi指出：“基因占据生物学的舞台已经数十年。但最近的工作提出，虽然基因经常是挂牌的名角，可它们更像一些木偶。各种蛋白质，有时是RNAs，在拉着线，告诉基因在何时何地打开或关闭”。7.1RNA世界——生命早期的遗传物质

RNA世界假说认为，在生命进化早期没有蛋白酶，某些RNA序列可以催化RNA的复制。也就是说，RNA是生命早期的唯一遗传物质，它是生命的源头。

在RNA遗传的基础上，才有了后来的DNA与蛋白质体系。事实上，RNA的遗传作用并未在生命的进化中消失，在一定程度，RNA仍在支配着DNA与蛋白质的命运。

Johnston等的工作证明，某种RNA分子确实能够催化RNA复制中的多聚化。

应用NTP及RNA模板的编码信息，使RNA引物持续增加14个核苷酸长度，等于RNA螺旋一圈。这种多聚化是RNA模板依赖的，是按照引物的序列、长度，以及RNA模板的信息进行的。证明了引物的3′是在与RNA模板逐一地、严格地配对的情况下进行的。结果，多聚化过程是逼真的；在引物被扩展11个核苷酸的情况下，对此等序列进行了克隆和序列分析，在1100个样品中有1088个是与模板标准匹配的。如表7.1

Bartel等使用存在于随机RNA序列的备用池中的RNA-连接酶ribozymes衍生物。某些衍生物能够使用NTP及RNA模板的部分区域进行模板指导的引物延伸。这些连接酶衍生物通过与模板的不配对的以特异小段的杂交来识别并催化该引物---模板复合体的RNA复制。从使用的模板的一小段来指导引物延伸来看，这些ribozymes不像复制RNA/DNA的酶的多聚化反应，更类似于末端酶。从上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA复制虽然效率不高，却是真正的RNA自我复制。因为它不像DNA复制那样，需要许多蛋白酶来进行加工。而这里的RNA复制，它不需要任何蛋白质，完全由RNA酶(ribozymes)及RNA模板完成。

而通常的DNA/RNA病毒的复制以及细胞DNA复制都不是由纯粹的DNA或RNA系统完成的。因此，RNA无疑地是一种复制模板。图7.3RNA复制实验7.2RNA干涉/扰7.2.1RNAi的分子机制RNA对基因表达的调控称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。

RNAi是一种转录后的基因沉默现象（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,是dsRNA触发细胞质中与其同源的mRNA的降解，或在细胞核中dsRNA诱导同源的DNA的后生修饰（甲基化）而导致转录水平上的沉默。

RNA沉默是一种阻遏外来序列的有效手段，并在动、植物发育中有重要作用。

1998年FireA.和MelloC.C在线虫中发现RNAi现象。获得2006年Nobel医学和生理学奖。RNAi作用机制：

在不同的生物中，不同来源的双链RNA(dsRNA，约500bp)被DICER（含有螺旋酶，helicase，dsRNA结合域，及PAZ功能域）裂解为一种具特异序列的有活性中间体---21~23nt的双链siRNA（smallinterferingRNAs或guideRNAs）。

然后，siRNA结合核酸酶复合物（RISC的蛋白质部分）形成RNA诱导复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一条链（GuideStrand）去寻找互补的mRNA链，然后RISC中的核酸内切酶（Augonate2,Ago2）在距离siRNA3＇端12bp的位置切割mRNA。

RNAi的分子遗传机制

基因mut-7及rde-2如果发生突变则导致内源转座子在生殖细胞中动员，称之为増变现象。说明RNAi过程是造成转位子抑制的原因。如果基因rde-1和rde-4发生突变，则对线虫注射dsRNA后缺乏产生RNAi的响应，在生殖细胞中也不能动员转位子。dsRNA被转换为特异序列中间体（R）,然后引起同源的mRNA降解/沉默。rde-1及rde-4为从dsRNA产生R所需要，mut-7及rde-2则被需要来响应R使靶mRNA沉默。7.2.2siRNA的产生与扩增

在线虫中，小量的dsRNA能够作用于大量的靶mRNA。这是因为dsRNA在转变为siRNA的过程中，至少有三种扩增途径。

1）Dicer酶可以把长的dsRNA截成10~20段，等于扩增10~20倍。2）存在一种催化机制，siRNA常常成倍增加，以用于进一步扩增。3）短的RNAs能作为靶mRNA的引物，在RNA依赖的RNA多聚酶的作用下，启动一个RNA指导的RNA多聚化反应，随后产生许多“次级siRNAs，称为靶指导的扩增。（图7.7）

首先dsRNA被切成短的siRNA,使dsRNA转换成ssRNA。这些单链正常的siRNA如果没有识别同源的靶mRAN，并与之配对，就会被降解。

一旦反义的siRNA与靶mRNA配对，则靶-指导的siRNA的扩增就会发生。这时，与靶mRNA配对的siRNA小段将沿mRNA延伸，但只能延伸几百个碱基左右就停止，并从该区裂解下来而成为次级siRNA。这种效应称之为“可迁移效应”。

siRNA与靶mRNA的稳定化与“可迁移效应”的结合就形成了一个“连式反应”，在这个反应中，随着Dicer的作用，primersiRNA的更新，以及新的一轮扩增，将发生siRNA的多轮的复制。

应该注意到，这种复制或扩增并不是自我复制/扩增，而是从primerA产生primerB,primerC,primerD,…这是从一个局部延伸为全体，再从全体裂解为若干局部的过程。7.2.3RNAi的遗传

它们是一些专与某一基因特异结合的片段，而且在它们应该发挥作用的特异的时空中，含量相当丰富，暗示着它们也许能够复制。Grishok等在线虫中的实验证明，RNAi性状是后生的，可遗传。它不需要通过基因序列的改变-----突变。线虫（C.elegant）实验(图10)：

1）注射dsRNA;

2）把虫子泡在含有dsRNA溶液中；

3）或者喂以正在表达有义及反义RNA的微生物。将dsRNA注射到线虫两性体，在子一代（F1）产生的基因沉默（RNAi）往往在F2消失。但是，在母性生殖系中，由RNAi引起的基因抑制，可以偶尔地遗传到F2及以后各代中（图7.8）。

Grishok等证明，如果RNAi在母体启动，它可以通过F1的精子传到F2，尽管该精子缺乏RNAi的靶基因。所以，RNAi一旦启动，即使在缺乏内源靶基因的情况下,雄性生殖系细胞能够传递RNAi。

因此，RNAi性状是后生的，可遗传的。它并不需要通过基因序列的改变----突变。7.3RNAi对基因表达的作用7.3.1RNAi是对基因组的基因表达的反馈RNAi的发现使我们对RNA调控基因认识不断深入。这种小的RNAs分子根据它们的来源不同被称为siRNA（shortinterferingRNAs）miRNA(microRNAs)。它们借助于互补的mRNA的结合，触发mRNA降解或阻止mRNA翻译成蛋白质。近年来研究表明，RNAi的途径不仅限于作用于基因组或使mRNA沉默。

在裂殖酵母中，RNAi是装配着丝点和使配对区异染色质化所必需的。并发现常染色质可因RNAi的作用而形成异染色质。另外，他们还发现，在特异的沉默机制下，在有性周期中可使用分散的内源DNA重复序列来抑制基因。（7.9）

现在已经证明，RNA从基因组上转录下来后能够反馈回去修饰基因组。这些修饰作用可以通过细胞分裂遗传下去并影响发育过程。7.3.2RNAi引导的同源RNA降解在动物、植物及真菌等各种生物中引起转录后基因沉默（PTGS）/RNAi的机制都是大同小异，高度保守的。说明它的古老起源。

基本机制是dsRNA被加工成更小的片段（siRNA），对同源mRNA进行识别与裂解，以及诱导DNA的甲基化而导致PTGS/RNAi现象。dsRNA的产生有多种方式包括：

反向的DNA重复序列的转录；有义及反义RNA的同时合成；

病毒复制，细胞/病毒的RNA依赖的RNA多聚酶（cRdRP/vRdRP）对单链RNA模板的转录。（图7.11）PTGS/RNAi产生的机制可分二步：第一步是dsRNA内切酶的作用，把sRNA加工成21~25nt的有义和反义的RNA(siRNA)，这些siRNA首先在植物中发现。在果蝇中，它们是由一种称为Dicer的RNaseⅢ所产生。Dicer已在线虫、S.pombe及哺乳动物中发现，它含有螺旋酶（helicase）,dsRNA结合域，及PAZ结构域。第二步因Dicer所产生的siRNA引导RISC裂解同源的单链mRNAs。RISC恰在反义siRNA与mRNA结合区域的中间切割mRNA,使mRNA进一步降解。

虽然RISC的大多数蛋白成分还不清楚，但已知到它含有内切酶、外切酶、螺旋酶及同源搜索活性。RISC的成分是PAZ/Piwi蛋白。通过PAZ域与Dicer作用把siRNA吸收到RISC中。评论：PTGS/RNAi现象的本质是不能正确地表达基因产物对基因的反馈调控。既然该基因已不能表达信息，就应该使其沉默。这种沉默不是DNA本身的突变，而是后生的基因沉默。这种后生的DNA甲基化是遗传的。这是一种对基因表达环境的一种可遗传的适应。7.3.3RNAi引导的同源DNA修饰RNA引导的同源DNA序列的胞嘧啶的从头甲基化是首次在类病毒感染转基因植物中发现的。继之，又在非病原的植物系统中发现。

RNA指导的DNA甲基化如同降解同源RNA一样，需要把dsRNA裂解为小RNA。只有与引导RNA互补的DNA序列才能够被甲基化，说明这是一个RNA-DNA相互作用的过程。

最短30bp的DNA序列可以作为甲基化的靶序列；甲基化可以发生于所有的胞嘧啶上，包括那些不存在对称的CpG岛；任何DNA序列，包括那些并不转录的启动子序列，均可被甲基化。那些含有启动子序列的dsRNAs自然可以指导同源的启动子的甲基化及转录沉默此外，作为PTGS效应而在细胞质中产生的RNAs也可以进入细胞核而触发同源DNA的甲基化。（图7.9，7.11）

RNA引导的DNA甲基化的蛋白质执行机构尚不明确，但起码要有DNA重新甲基化酶（DNMT）以及能打开dsRNA的RNA螺旋酶。RNA引导的DNA甲基化是否需要dsRNA或小的RNA降解物尚不确定。

研究认为小RNA是用于接近部分打开的DNA以形成RNA-DNA双链或DNA单链L单链Loop。这些结构可以吸引DNMT。或者说，小RNA可能与DNMT作用，并把该酶引导到同源DNA序列上去。DNMTN可能是色甲基酶。可以设想，小RNA通过色结构域与色结构酶相作用去指导同源DNA序列的甲基化或维持非CpGs部位的甲基化。（图7.9，7.11）

已经发现果蝇组蛋白乙酰酶MOF的色结构域起着RNA相互作用模块作用。MOF的例子使人们想到，引导RNA不仅能进行RNA指导的DNA甲基化，也能对基因组的特异区域进行非甲基化的染色质修饰。

哺乳类及果蝇的X染色体的剂量补偿，某些哺乳类基因组记忆，包括非编码RNA、重叠及反义RNA等，都可能是染色质修饰或甲基化现象。7.4RNA编辑7.4.1RNA编辑是对中心法则的挑战mRNA的序列与其DNA模板的序列是严格的一一对应的，这种序列的共线性是中心法则的基本概念。1977年intron的发现，中心法则及序列学说受到极大震撼。

现在认为mRNA与其DNA模板序列的严格对应已不可能，以从全面对应退而为部分对应。mRNA在成熟过程中被莫名其妙的删掉非编码序列---intron,剩下的为编码序列还是严格对应的。显然Intron不是中心法则所希望的东西。

1985年，在动物线粒体中发现一些RNA的polyA尾巴中有终止密码。众所周知，polyA是在转录后才加上去的，与DNA模板根本谈不上对应关系，也绝不会有编码序列。然而出现的这个终止密码却偏偏是64个密码之一，好在这个密码在polyA之内，RNA编码的格局未被破坏。

在病毒、原生动物、哺乳动物及植物的RNA中都发现有U，A，C，G的删除、插入与替换，这种转录后的修饰过程，称为RNA编辑（RNAediting）。（表7.2）RNA编辑（RNAediting）早在1986年由Benne等在布氏锥虫及簇生短膜虫中发现。它们的线粒体的coχll基因(细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ)的mRNA5′端含有4个非基因编码的U残基，正是由于它们的插入而抑制了原来基因的移码，形成完整的开放性读框，产生了有活性的fox。

一万个1kb小环，功能不清。T.brucei的mtDNA50个22kb大环，即大环基因。锥虫许多大环的转录本（RNA）是无功能的，因为它们缺乏适当的翻译起始密码，或含有移码序列。某些锥虫由于U的插入或缺失在大环基因的RNA的富嘌呤的小范围进行。RNA编辑结果是增强它们的翻译能力。如果基因移码框架被消除，建立AUG起始密码，同时改变了某些氨基酸，而在短膜虫的MURF-3RNA中则从其读框中段形成了一个潜在的起始密码。Benne认为，这表明RNA编辑可能对基因的表达有调控作用（正/负）。总之，mRNA编辑，尤其是大幅度的编辑涉及到mRNA的密码子大部分，致使它们从无意义成为有意义的信使，而它们原来的基因，亦即基因组DNA只不过是一串简略意义的模糊序列。7.4.2模糊基因（crytogenes）Simpson与Shaw把被RNA编辑的基因称之为模糊基因或叫隐秘基因，在本书中模糊基因。Simpson等将模糊基因分为三类：类型Ⅰ：内部编辑的模糊基因,只在其转录本的蛋白编码区内部进行编辑。如,coχⅡ,MURF3。类型Ⅱ：5′端编辑的模糊基因,只在其转录本的5′端蛋白编码区内进行编辑；如，MURF2,MURF3,coχⅢ等。类型Ⅲ：泛编辑的模糊基因，在其转录本的全长进行编辑而产生一个全新的蛋白质。如，MURF4,MURF3,coχⅢ，编辑的模糊基因7.4.3.1guideRNA(gRNA)模型研究表明，RNA编辑并无即存模板可依。

在锥虫中发现有一些短的RNA，以其5′端开始与被编辑的模糊mRNA互补结合，以其3′提供增删某核苷酸（U,C,G,等）的信息，被称为引导RNA（guideRNA,gRNA）。有关增删的机制，仅限于一些针对锥虫gRNA的模型。如：Simpsonmodel,主要是以简单的酶切机制。（图7.13）

Cechmodel,以转酯反应为主。（图7.14）7.4.3RNA编辑模型357.4.3.2高等动物RNA编辑酶Fox发现，植物线粒体基因某些密码子与其蛋白产物的氨基酸密码子并不一致，说明从DNA到蛋白质的序列信息逐一精确对应的中心法则并不是普遍的法则。而后发现这是对线粒体的转录本进行了RNA编辑。而这种编辑不仅限于植物线粒体，也存在于高等动物基因组的转录本的加工中。2000年，Wang等描述了细胞核中的RNA编辑酶ADARs（adenosinedeaminasesactingonRNA，ADAR）。这种转录本的编辑是小鼠、果蝇的胚胎发育是需要的。

脊椎动物有三个ADAR基因，ADAR1是首先被发现，它经常与

ADAR2在各种组织中表达。ADAR3仅仅在脑中表达，尚不知是否有酶活性。看来，RNA编辑酶及其RNA编辑远比我们想象的重要和普遍。该过程的关键是把基因中的内含子拉入到编码过程中。（图7.15）

编辑部位的互补序列（editingsitecomplemetarysequence,ECS）是RNA编辑酶（ADAR