第三章生物材料的预处理和液固分离

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一、生化制药工艺技术基础

二、微生物制药工艺技术基础

三、生物技术制药工艺技术基础

第一节生物材料的预处理

一、选择预处理方法的依据1、生物活性物质来源、存在状态“胞内”、“胞外”

微生物酶—胞外培养液

DNA与电子传递系统物质（氧化磷酸化的酶系）--线粒体2、后续工艺要求3、目的物稳定性--可被材料中酶、微生物破坏，还可能受酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线作用改变活性。第三章生物材料的预处理和液固分离

防止目的物的失活放在首位二、细胞培养液的预处理

（一）杂蛋白质的去除1、凝聚作用---在某些电解质作用下，使扩散双电层的排斥电位（即ζ电位）降低，破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒聚集的过程.

原理：在发酵液中加入具有相反电性的电解质：①中和胶粒电性，降低双电层排斥力.②离子的水化作用，破坏胶粒的水化层.

离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序:

Al3+＞Fe2+

＞H1+

＞Ca2+

＞Mg2+

＞K1+

＞Na1+

＞Li1+

常用的凝聚剂：Al2(SO4)3.18H2O(明矾）

AlCl3.6H2O，FeCl3.ZnSO4，MgCO3.。

。

2、絮凝作用

指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒粗大絮凝团的过程。

絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团.如：壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。

影响絮凝效果的因素主要有：（1）絮凝剂的分子量（2）絮凝剂的用量（3）溶液pH值（4）搅拌速度和时间3、变性沉淀—加热紫外有机溶剂等4、等电点沉淀

5、加各种沉淀剂沉淀---三氯乙酸盐各种金属(Ag+Cu2+Zn2+)等6、吸附---例如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去.（二）、多糖的去除

可用酶转化为单糖黏多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）生成沉淀去除。（三）、高价金属离子的去除

1、离子交换法2、沉淀法Ca2+-------草酸

Mg2+---------磷酸盐Fe3+----------黄血盐第二节细胞破碎

动植物和微生物的细胞壁结构差别很大动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，易于破碎植物和微生物细胞具有坚固的细胞壁，破碎困难一、细胞的结构破碎细胞的目的--使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，

释放其中的目标产物。。为何进行细胞破碎？二、动物材料的预处理动物细胞因没有细胞壁容易破碎。动物组织匀浆的一般步骤是：先将动物组织切成碎块，悬在冰冷的匀浆缓冲液中，在捣碎机中研磨。三、细胞的破碎技术（一）机械法1、高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成，主要利用液相剪切力与固定表面撞击所产生的应力，使细胞破碎。蛋白质变性问题2、珠磨法微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂（通常是d<1mm的无铅玻璃珠）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，桨液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。

高压匀浆和高速珠磨法比较指标高压匀浆法高速珠磨法操作参数少多操作次数多次一次冷却用换热器级间冷却珠磨机兼有冷却作用应用范围丝状真菌和小革兰氏阳性菌除外所有微生物料液损伤小大

3、超声波破碎

超声波破碎法利用发射声频高于15—25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液进行细胞破碎.可能机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。（二）、非机械法

1、干燥法空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥

2、物理法1）渗透压冲击法---先把细胞放在高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨胀，使产物释放至溶液2）冻结—融化法3）微波加热3、化学法（1）作用机理通过改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方法称为渗透法。（2）常用的化学试剂有机溶剂（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性（SDS、TritonX-100)、金属螯合剂（EDTA)、变性剂（盐酸胍、脲）等。

(3)丙酮法保存化学渗透法的优缺点：（与机械法比较）1)优点：①对产物释放有一定的选择性.②细胞外形保持完整，碎片少，有利于后分离.③核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取.2）缺点：①时间长，效率低.②化学试剂具有毒性,进一步分离时需要用透析法除去.③通用性差,某种试剂只用于某些特定类型的细胞.物理法和化学法的比较物理破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离.

化学破碎法缺点：A、费用高.B、引起新的污染，尤其是其他化学方法.C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用.4、酶溶法—生物法利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁消化溶解，受到部分或完全破坏的方法。

通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。溶菌酶:它是一个小分子酶，能破坏细菌细胞壁的糖链，从而破坏其完整结构，使细菌裂解死亡。

酶溶法处理细胞存在的问题：

①存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。②酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。③通用性差，不同的菌株用不同的酶。（三）、选择破碎方法的依据

1、规模及成本2、目的物的稳定性3、破碎效果和产物释放率4、提取产物在细胞质内，用机械法破碎5、提取产物在细胞膜附近，用化学法6、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法破碎率的测定（1）直接测定法：利用适当的方法，记数破碎前后的细胞数即可直接计算破碎率（显微镜、染色）（2）目的产物测定法：测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率（比如蛋白的含量或活性）（3）导电率测定法（测定破碎前后导电率的变化，导电率随着破碎率的增加而呈线性增加）第三节液-固分离(过滤）一、过滤方式

1、常规过滤

溶剂和小于膜孔的溶质在压力的驱动下透过膜，大于膜孔的颗粒被截留，通常堆积在膜面上.但是,随着时间的增加，膜面上堆积的颗粒也在增加，过滤阻力增大，膜渗透速率下降。因此必须周期性的停下来清洗膜表面的污染层，或者更换膜.操作简单，适于小规模场合.

2、错流过滤

在泵的推动下料液平行于膜面流动，与死端过滤不同的是料液流经膜面时产生的剪切力把膜面上滞留的颗粒带走，从而使污染层保持在一个较薄的水平.

二、过滤设备

1、板框过滤机(间隙操作)是由滤板、滤框（板框式）排列构成滤室，在输料泵的压力作用下，将料液送进各滤室，通过过滤介质，将固体和液体分离.广泛应用于化工、染料、石油、陶瓷、制药、制糖、食品、淀粉及各行业的污水处理等.

2、真空式连续过滤机(连续式):

以过滤布或滤网为介质，使料浆水平布置于过滤介质之上，充分利用料浆重力和真空吸力实现固液分离。连续水平真空带式过滤机可适用于多种浓度条件下的物料，过滤效高.

特点：喂料、过滤、洗涤、脱渣、滤布再生可连续自动完成，自动化程度高三、过滤介质和助滤剂1、过滤介质：滤布或膜2、助滤剂：要求为惰性物质、无毒、有一定细毒及硬度，成本低廉。

常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等第四节沉淀一、盐析1.定义：是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大.盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小.2.盐析原理：（1）形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。（2）中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。3、影响盐析的因素（1）无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+

常用：硫酸铵

（2）溶质（蛋白质等）种类的影响（3）蛋白质浓度的影响蛋白质浓度提高，盐用量减少。（4）温度的影响在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。（5）pH的影响当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，可以分级沉淀蛋白质.

4、盐析操作（1）盐析用盐的浓度表示固体粉末、硫酸铵饱和溶液常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1mol／L,767g/L，定义它为100%饱和度.（2）盐析方法和注意事项分级盐析法重复盐析法反抽提法：一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀，将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白.

注意事项：“局部过浓”温度（室温）分离方法反抽提法(RNA聚合酶)二.有机溶剂沉淀法1.定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。2.基本原理：（1）降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。（2）水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆.三、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。与盐析法结合用。例如味精生产，利用等电点(PH3.22)沉淀法提取谷氨酸.胰岛素纯化：

胰岛素的粗提物

pH8

除去碱性杂蛋白

pH3除去酸性杂蛋白四.生物碱试剂和某些酸类沉淀法当溶液PH<PI时，蛋白质颗粒带正电荷→易与生物碱酸根负离子反应→沉淀

例如：单宁酸、苦味酸、钨酸。

用途：临床可用于检验尿中蛋白质。五、重金属盐沉淀法当溶液PH>PI，蛋白质颗粒带负电荷，易与重金属离子－→生成沉淀

Ca2+-------草酸成盐

Mg2+-------三聚磷酸盐

Fe2+--------黄血盐用途：抢救误服重金属盐的病人六、高分子聚合物沉淀

水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。七、表面活性剂

十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）第五节结晶技术(crystallization)1、结晶：

溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列。

固体有结晶和无定形两种状态(1)结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则。(2)无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则.2、结晶操作的特点(1)只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。(2)通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。(3)结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。结晶过程的实质(1)结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。(2)这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中，这一过程与表面分子化学键力变化有关；(3)因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。3、结晶过程分析稳定区和亚稳定区在温度-溶解度关系图中，SS曲线下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；而在SS曲线和TT曲线之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至SS线；介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区和养晶区不稳定区在TT曲线的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至SS线（饱和）；晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，晶体质量差；因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。过饱和溶液的形成

(1)、蒸发法---(小分子化合物)(2)、温度诱导法热盒技术(3)、盐析结晶法结晶包括三个过程：(1)形成过饱和溶液;溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。(2)晶核形成;(3)晶体生长。(4)、透析结晶法(5)、等电点法(6)、化学反应结晶法调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。

晶体的形成(1)形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。(2)首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。凯尔文（Kelvin）公式C2---小晶体的溶解度；

C1---普通晶体的溶解度σ---晶体与溶液间的表面张力；ρ---晶体密度γ2---小晶体的半径；

γ1---普通晶体半径

R---气体常数； T---绝对温度晶体生长在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为晶体生长。影响晶体生长速度的因素：(1)杂质：改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂质吸附导致的晶体生长缓慢；(2)搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成；(3)温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶速度；提高晶体质量的方法晶体质量包括三个方面的内容： 晶体大小、形状和纯度(1)影响晶体大小的因素： 温度、晶核质量、搅拌等(2)影响晶体形状的因素： 改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质(3)影响晶体纯度的因素：母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布重结晶：经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有一定量的杂质。此时工业上常常需要采用重结晶的方式进行精