第七章发酵工艺控制

第七章发酵工艺控制本章主要内容：1、工业发酵的主要类型2、工业发酵的主要控制参数3、染菌对发酵的影响及防治4、发酵工艺的放大5、发酵过程的自动控制本章重点掌握：菌体浓度、基质、溶氧、PH值、温度、泡沫、CO2等参数对发酵的影响。本章主要内容第一节工业发酵的主要类型一、按投料方式分1、分批发酵(batchfermentation)

2、补料分批发酵(fed-batchfermentation)3、连续发酵(continuousfermentation)。1、分批发酵概念：

分批发酵：指将微生物和营养物一次性加入发酵罐中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式，中间除了空气进入和尾气排出，没有物料交换。在分批发酵中，培养基是一次性加入，不再补充，随着微生物的生长繁殖活跃，营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，因此其生长速度将随时间发生有规律性的变化。迟滞期对数期恒定期衰亡期时间细菌数目的对数分批发酵微生物的生长曲线

微生物的生长曲线延滞期主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。缩短延滞期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致、保证培养基适宜的营养浓度。缩短延滞期目的：缩短发酵周期、增加产量和避免染菌。指数生长期指数期微生物的生理特征：养分空间充足，排出的代谢废物浓度还不影响生长，此期分裂速度最快、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳时期。稳定期特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续发酵技术。衰亡期

细胞死亡率增加，明显超过新生率，进入衰亡期。多数发酵在到达衰亡期前就结束。

特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。衰亡期比其它期相对较长。分批发酵优缺点：优点：操作简单周期短染菌机会少产品质量易于控制缺点：生产能力不是很高非生产周期较长，使得发酵成本高二、连续发酵

1.概念：

微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时以相同速度不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态下生长的培养方式。实验室连续培养系统示意图

(a)恒化培养系统(b)恒浊培养系统1容器2控制阀3培养室4排出管5光源6光电池7流出液

2.特点：

菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度均处于恒定状态。3.连续培养的优缺点优点:可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定。能够更有效的实现自动化，降低劳动强度，减少工人与病原微生物和毒性产物接触的机会。减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时。由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命延长。容易对过程进行优化，有效提高发酵产率。缺点:长期连续培养会引起菌种退化，降低产量，发酵周期长染菌机会增加。对设备、仪器及控制器件的技术要求较高。粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液中结团，给连续发酵操作带来困难。应用：常用于研究工作中，废水处理、面包酵母、啤酒发酵等工业中。三、补料分批培养概念：补料分批发酵(fed-batchculture，简称FBC)，又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。补料分批培养是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。

补料分批培养分两种类型：①单一补料分批发酵：指在开始时投入一定数量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加一种或多种成分的新鲜培养基，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后停止补料，最后将发酵液一次性全部放出。②反复补料分批培养：单一补料的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大容积。2.补料分批培养的优缺点优点：与分批培养相比①解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。②可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响；③可用作为控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；④可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。

与连续培养相比优点①降低了染菌，避免了遗传不稳定性。②产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。

二、按菌体生长与产物形成关系分1、生长关联型特点：菌体生长、基质消耗和产物合成大体上呈正比关系（菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关）。如：单细胞蛋白、葡糖酸和酒精发酵2、生长部分关联型产物形成和菌体的生长是部分分开的。菌体生长和产物合成是分开的，糖分既供应生长的能量，又充作产物合成的碳源。发酵过程中有两个时期对糖的利用最为迅速，一个是最高生长时期，另一个是最大产物合成时期。如：柠檬酸和部分氨基酸发酵3、生长无关联型发酵过程分两个阶段特征是产物合成与碳源利用无准量关系；通常产物合成在菌体生长停止及底物耗完后才开始。如：许多抗生素和色素的发酵

第二节工业发酵过程的主要控制参数一、物理参数1、温度与温度有关的因素：氧在培养液中的溶解度和传递速率菌体生长速率和产物合成速率测量工具：铂电阻或热敏电阻2、压力（Pa）与压力高低有关的因素：罐压高低与氧和CO2在培养液中的溶解度有关罐压一般范围：0.2×105～0.5×105Pa测量工具：

隔膜法压力表或压敏电阻压力表3、搅拌转速（r/min）

影响搅拌转速的因素：氧和CO2在培养液中的溶解度发酵液的均匀性测量工具：

频率计数器或转速表

4、搅拌功率（KW）

指每立方米发酵液所消耗的功率。

5、空气流量（vvm）

指每分钟内向每单位体积发酵液通入的空气体积。空气流量一般控制在0.5-1.0vvm6、黏度（Pa.s）

测黏度的意义：细胞生长活细胞形态的一项标志；发酵罐中菌丝分裂过程情况。测量工具常用涡轮旋转式粘度计7、料液流量（L/min）

控制流体进料的参数。二、化学参数1、pH2、基质浓度（g/L或%）3、溶氧浓度（mmol/L,mg/L）4、氧化还原电位（mv）5、产物的浓度（μg/ml）6、废气中的氧浓度（Pa）7、废气中的CO2浓度（%）

三、生物参数1、菌体形态菌体形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。用显微镜观察菌体形态2、菌体浓度

概念：菌体浓度是指单位体积培养液中菌体的含量。根据菌体浓度的大小决定适合的补料量和供氧量，同时可判断目的产物的产量是否达到最大量。一、菌体浓度对发酵的影响（1）菌体浓度大小直接影响产物产率

一般说，菌体浓度越大，产物产率越大。但是菌体浓度过大反而有副作用：浓度过大，营养物质消耗过快，可能引起发酵液性质明显改变和有毒代谢产物的积累，从而改变了代谢途径。对于微生物的产物生成与生长呈部分关联型，如果菌体浓度过大，营养基质大部分用来满足菌体的生长，到产物生产期营养不足导致产率降低。（2）浓度对发酵液溶解氧的影响

菌体浓度增加，摄氧率增加，但表观黏度也随之增加，氧的传递速率降低，当摄氧速率大于供氧速率时，溶氧浓度由于不足就会成为限制因素。

为了获得最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。二、菌体浓度的控制

控制菌体浓度的措施：

通过改变基质浓度及中间补料控制菌体浓度。三、发酵过程菌体浓度的检测

常用的方法有：浊度法、干重法、离心称重法或测体积法。

浊度法：使用的仪器为分光光度计

方法：取发酵液在420-600nm波长范围内测定光密度（OD）值。吸光度要求控制在0.3-0.5范围内，这个范围内发酵液浓度与吸光值正相关，不在此范围内的要稀释发酵液。第四节基质浓度对发酵的

影响及控制一、基质浓度对发酵的影响1、基质浓度对菌体生长的影响菌体比生长率与基质浓度曲线图为抛物线形如下图。

2、基质浓度对产物形成和发酵液特性的影响基质浓度过浓可能会导致以下现象：①可能会改变产物的代谢方向或产生产物合成的阻遏现象；②菌体生长过旺，发酵液过于粘稠，菌体细胞消耗能量维持生存环境，用于非生产能量增加。③基质浓度过大，使发酵液黏度过大，从而影响溶解氧的传递，进而影响菌体的生长和产物的合成。二、基质浓度的控制

用中间补料的方法控制基质浓度。有效性进行中间补料，要做到选择恰当的补料内容、补料方式和反馈控制参数。补料内容：指补加的培养基成分。选择限制性的一种或几种成分加以补充。补料方式：指补料时机和补料顺序。

补料方式分为：分批补加和连续流加，连续流加又分为等速补料和变速补料等方式。反馈控制参数：指导补料方式的控制参数。直接反馈控制参数:控制碳源、氮源或碳氮比。间接反馈控制参数：溶氧、pH、呼吸熵、排气中二氧化碳分压及代谢物浓度。

第五节溶解氧浓度对发酵的影响及控制一、溶氧浓度对发酵的影响影响耗氧的因素有以下几方面：

⑴培养基的成分和菌体浓度显著影响耗氧⑵菌龄影响耗氧⑶发酵条件影响耗氧1、溶氧浓度对微生物生长的影响微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量，以QO2表示，单位为mmolO2／(g干菌体·h)。耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmolO2／(L·h)。

式中r——微生物的耗氧速率，mmolO2／(L·h)；

——菌体的呼吸强度，mmolO2／(g干菌体·h)；X——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。生长临界氧浓度：

P95各种微生物生长对发酵液中溶解氧浓度有一个最低要求，这一溶解氧浓度称为生长临界氧浓度。培养过程中不需要使溶解氧浓度达到饱和值。一般微生物生长临界氧浓度是饱和浓度的1%-30%。溶氧浓度高于临界溶氧浓度时,对微生物的生长有利（）。判断临界氧浓度溶氧浓度2、溶氧浓度对产物合成的影响产物合成临界氧浓度：微生物产物的合成也有一临界溶氧浓度，称为产物合成临界氧浓度。

产物的合成也有一合适的溶解氧浓度，溶解氧浓度太高反而会抑制产物的合成。最佳合成溶氧浓度可能低于最适生长溶氧浓度或生长临界氧浓度，也可能高于最适生长溶氧浓度或生长临界氧浓度。第一类：有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在溶氧浓度高于或等于生长临界浓度的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第二类：包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；第三类：有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。

亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸最佳合成氧浓度分别为生长临界浓度的0.55倍、0.6倍和0.85倍。判断：在生产中，要保证最高产物产量，供氧时必须使溶氧浓度大于生长临界溶氧浓度（）。需氧发酵产物合成是不是溶氧愈高愈好,为什么?举例说明。问题二、发酵液溶解氧浓度控制（一）从供氧方面控制氧的传递速率总方程式：

N=KLα（C*-CL）式中：N---单位体积培养液中的传氧速率，[mol/m3·s]；

KL---以浓度差为推动力的总传质系数（m/s)α–比表面积（m2/m3)KLα---以浓度差为推动力的体积传递系数，（s-1）；CL---发酵液主流中氧的实际浓度，（mol/m3）；

C*---罐中氧分压下溶液中氧的饱和浓度（mol/m3）；

α很难测定，

KLα可作为一项，称之为液相体积传氧系数。

根据供氧速率公式，凡影响（c*-CL）和KLα的因素都会影响氧的传递速率。

1、影响（c*-cL）的因素及控制

要想增加氧传递的推动力（C*－CL），就必须设法提高C*（氧分压下溶液中氧的饱和浓度），或降低CL（发酵液主流中氧的实际浓度）。

（1）提高饱和溶氧浓度C*影响因素C*有：①温度：发酵温度依据微生物生理特性而定，不能任意变动.②溶液的组成：随浓度降低氧饱和度提高。可通过开始用较稀培养液浓度，然后中间补料的方式，同时在发酵中后期，可通入无菌水降低基质黏度来提高溶氧度，但有局限性。③罐压：罐压增加，溶解氧浓度增加，但CO2也增加且更快。不利于液相中CO2排出。对细胞渗透压有不利影响。④富氧通气：富氧通气、溶解氧增加。但生产成本提高，不够经济。（2）降低发酵液中氧的实际浓度CL

降低发酵液中的CL，可采取减少通气量或降低搅拌转速等方式来实现。但是，发酵过程中发酵液中的CL不能低于C临界，否则就会影响微生物的呼吸。目前发酵所采用的设备，其供氧能力已成为限制许多产物合成的主要因素之一，故此种方法亦不可取。2、影响KLα的因素及控制措施比表面积α：气泡表面积与体积之比，比表面积越大，氧传递速率越大。所以影响氧传质系数KLα的主要因素有：搅拌效率空气流速发酵液的理化性质、泡沫状态空气分部器形状和发酵罐的结构等影响KLα的因素（1）搅拌：

①搅拌使汽泡变小，增大汽液相接触面积，延长汽泡在液体中的停留时间；增加湍动程度，减小气泡外液膜厚度，减小阻力，使KLα值增大；搅拌避免结团，使培养基成分和细胞均匀分布，利于营养物吸收，代谢物扩散。搅拌比通气速度对KLα的影响更明显。但搅拌速度过高，会对细胞造成损伤，并会增加传热的负担；通气效率还与罐体积（越小越好）、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。影响KLα的因素（2）空气流量：供氧，带走废气。KLα随空气流量增加而增加，但有限度。如超过限度，搅拌器在空气泡中空转，不能分散空气，搅拌功率下降。气沿轴逸出。因此，发酵过程中，应控制空气流量，使搅拌轴附近没有大的气泡溢出。影响KLα的因素（3）发酵液的理化性质

理化性质对KLα的影响主要有黏度、泡沫等因素。黏度KLα↓氧的溶解速率↓

泡沫：发酵过程中形成的泡沫易于菌体形成稳定的乳浊液，阻碍氧的传递。

消沫措施：消沫使KL下降（虽使α

增大）①加入消沫剂（过多积累对菌体有害）

②安装消沫器影响KLα的因素（4）空气分部器和发酵罐的结构空气分部器有多孔环状和单孔两种。如多孔环状分部器直径大于搅拌器直径，空气会沿罐壁溢出，供氧效果差。空气流量达到一定程度后，单孔分部器有优势，可增强发酵液的湍动程度。（二）从耗氧方面考虑对发酵液溶解氧浓度控制

微生物耗氧与微生物的比生长率呈正相关，控制微生物营养物质浓度，从而控制其对氧的需求量。第四节中的内容三、发酵过程中溶解氧的检测（一）发酵过程中溶解氧检测的意义1、检测溶液氧可度量发酵中氧是否足够，了解微生物耗氧规律如：头孢霉素生产中，发酵初期溶解氧浓度控制在饱和溶解浓度左右，而后期溶解氧浓度则控制在饱和浓度的10%-29%。

2、溶解氧浓度作为发酵异常情况的指示溶氧异常下降：P98原因：①污染好气性杂菌

②菌体代谢发生异常现象，需氧量增加

③某些设备或控制工艺发生故障。溶氧异常上升：原因：①菌体代谢发生异常，需氧下降

②污染噬菌体，菌体呼吸受抑制

在发酵过程中引起溶氧异常升高或下降可能有哪些原因

?（二）溶解氧（DO）检测方法

采用复膜氧电极测定法

复膜氧电极有两种类型：

1、原电池型：银阴极和铅阳极置于碱性电解质中.

2、极谱型：管状银阳极、铂丝阴极、氯化钠电解液和极化电源组成.

第六节

pH值对发酵的影响及控制发酵液pH对菌体生长、繁殖和产物积累影响较大。生产前应进行试验和研究。菌体生长、繁殖和产物积累的最适pH不一定相同。微生物生长最适pH值范围

不同的微生物具有不同的最适生长的pH值。细菌6.5-7.5；放线菌6.5-8.0；霉菌4.0-5.8；酵母菌3.8-6.01、pH对发酵的影响pH对微生物生长和产物形成影响主要体现以下方面：pH影响基质和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。pH影响酶的活性，以致影响菌体的生长和产物的合成；甚至代谢途径会改变。pH影响菌体细胞结构的变化和细胞形态的变化，从而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成。pH还对发酵液或代谢产物产生物理化学的影响，特别是对产物稳定性的影响。如噻纳霉素、青霉素二、发酵过程中pH的变化培养基中营养物质的代谢和代谢产物的产生引起pH的变化：培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子氮源被利用后产生NH3

，则pH上升；有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。生理酸性物质和生理碱性物质的消耗。引起发酵液中pH下降和上升的因素：P100三、发酵过程pH的确定和控制1、pH的确定因发酵过程中菌体本身具有调节pH的能力，另外菌种不同和代谢产物不同pH不同，所以pH的确定要以试验的结果来确定。2、pH的控制选择pH值的方