放射性自显影技术

第四章放射性自显影技术第一节原理和一般制作程序第二节放射自显影的制作方法第三节与自显影质量有关的几个因素第四节放射性自显影技术的应用第一节原理和一般制作程序

一、放射性自显影的原理和特点

放射性自显影

利用照相乳胶记录、检查和测量样品中放射性核素的分布、定位和定量的方法。

放射性自显影的特点（1）准确定位；（2）灵敏度高；（3）能保持机体的完整结构；（4）可以长期保存；（5）操作简便，不需要复杂的仪器和设备。

局限性：

定量误差大，只作相对定量；测定的速度较慢。（一）自显影标本的制备（二）曝光（三）显影（四）定影（五）水洗及干燥二、放射性自显影的一般制作程序1.洗净；2.吸水纸吸干；3.平铺于标本夹；4.干燥。（一）自显影标本的制备

曝光

:把照相乳胶曝露于射线而产生潜影。

1.感光材料的选择:

由溴化银和明胶组成。明胶是溴化银的支持剂，又是溴原子的吸收剂；它决定着乳胶的通透性、吸水膨胀、浓度稀释和坚膜作用等特性。而乳胶的敏感度决定于溴化银的浓度、颗粒大小及其配制方法。（二）曝光

乳胶名称卤化银晶体直径（μm）卤化银

(%)晶体粒子数/1000μm3灵敏度分辨力产品特点适用范围幻灯片电影胶片~110~156差中乳胶层约15μm涂于片基的一面宏观或光学显微自显影X射线乳胶片0.2~310~206高差乳胶层约30μm涂于片基的两面宏观自显影核乳胶0.02~0.54510000高高液体、干板、脱基膜光学显微及电镜自显影几种自显影感光材料的性能

（1）在有效期内使用。（2）周围不能有放射性物质。（3）X射线乳胶片和幻灯片应注意避光、防潮、防热，最好在恒温恒湿房间（15~20ºC）保存；（4）液体核乳胶应置于棕色玻璃瓶中，外用黑纸包好，再用塑料袋包好，保存于4ºC冰箱内。感光材料的保存：

2.曝光（1）潜影的形成

将溴化银的晶体点陈制作成有缺陷的，这些缺陷构成潜影过程中的敏化中心。

当核射线、光线、热、压力等作用于溴化银时，溴化银中的电子便向敏化中心移动，形成带负电荷的静电层，然后正电荷的银离子便向静电层聚集而变成银原子，形成潜影。--------++++1234潜影的形成

（2）曝光时间

a)以公式计算曝光时间：

设L为单位面积上衰变了的放射性活度；

A0为单位面积上开始时的放射性活度；

At为单位面积上曝光结束时的放射性活度。由L=A0–At；At=A0e-λt

得：

t=LnT0.693A0A0-L

b）经验估计

要使X乳胶产生适宜的黑度，大约需要500～1000万β粒子或100～200万α粒子/cm2。对于β粒子来说：

N/At

c）实验曝光法×曝光时间=（0.5~1）×107

粒子/cm2

显影

指感光后形成潜影的乳胶，在显影剂的作用下，使潜影转化为金属银的过程。

（1）显影液的组成：显影剂：常用米吐尔，主要起还原作用。

促进剂：常用碳酸钠，维持碱性条件。

保护剂：常用亚硫酸钠，中和氧化产物。

抑制剂：常用溴化钾，抑制未感光的银盐。

（三）显影（2）显影条件

配制好的显影液应盛于带盖的深色玻璃瓶中，置于阴凉处或冰箱中。在温度为18～20ºC的条件下，显影时间约为5～6分钟。

定影

定影剂硫代硫酸钠和溴化银作用，将溴化银溶解，从而使未感光的银盐从乳胶中溶去而成为透明膜。

其反应式如下：

AgBr+Na2S2O3

⇌NaAgS2O3+NaBr

NaAgS2O3

⇌Na++[AgS2O3]-

NaAgS2O3+Na2S2O3

⇌

Na3Ag(S2O3)2（四）定影

（1）定影剂：硫代硫酸钠，遇酸易分解。（2）保护剂：常用亚硫酸钠，抑制定影剂的遇酸分解。（3）停显剂：常用醋酸、硼酸，中止显影。（4）坚膜剂：常用明钒、铬钒。2.定影液的组成

3.定影条件

温度以19~20ºC为宜，定影时间约为10~15分钟。

（五）水洗及干燥

定影后要经充分水洗，以清除残余的定影剂和未被显影的银盐。一般要求在流水中冲洗20~30分钟，然后在空气中晾干。第二节放射性自显影的制作方法

一、宏观放射性自显影的制作方法

（一）整体植株的放射性自显影（二）放射性纸层析和薄层层析板自显影（三）土壤整段标本的放射性自显影（四）观察

二、光学显微自显影

(一)方法

1.接触法

将试验样品制成石蜡切片，用蛋白甘油将石蜡切片贴在载片上，可先染或曝光后染色，干燥后在暗室中将乳胶面对切片，紧密接触，进行曝光。

2.液体乳胶法

在暗室安全灯下，将所需的乳胶称出，使其装入烧杯中，置于40ºC水浴溶解。然后采用滴涂或浸蘸法将乳胶直接加在载玻片上，并使均匀地铺开。凉干后连同标本一起进行曝光。

具体又可分为：涂布法和浸蘸法。涂布法和浸蘸法示意图

（二）染色

1.前染

是指涂核乳胶前对切片进行染色。优点：乳胶层不被染色，与后染相比颜色清晰鲜明。缺点：染色处理可能引起标本中放射性的损失；对易溶性放射性化合物不宜采用前染。

2.后染

是指在切片涂布核乳胶、曝光、显影、定影后进行的染色。

优点：没有前染的放射性损失问题；

缺点：在染色过程中可能会使显影银粒消失，乳胶脱落。

1.粒子计数法

在一定面积上或一定细胞器上的显影银颗粒的多少确定样品中的放射性高低。

2.径迹计数

根据较厚乳胶层中产生的径迹数，来测定放射性。

3.光密度测定：用显微光度计（三）光学显微自显影的观察与分析第三节与自显影质量有关的

几个因素一、各种粒子在乳胶中的径迹α粒子：径迹直，密度均匀，图像最好。β粒子：径迹弯弯曲曲，射程因能量而异。γ粒子：一般在乳胶中不留什么痕迹。

分辨力

用银粒密度最大的点与其密度减少到一半的点之间的距离（HD）来表示。

影响分辨力的因素：

（1）溴化银颗粒的大小（2）乳胶厚度（3）标本厚度(4)标本与乳胶层的距离（5）射线的能量：3H、14C、32P

（6）曝光和显影时间二、分辨力

自显影效率

指一个入射粒子所生成显影颗粒数目。其受下列因素影响：

（1）射线能量（2）标本的厚度（3）乳胶层的厚度：小于射程时（4）溴化银结晶的大小：小而密时（5）乳胶的灵敏度（6）乳胶层与标本的距离（7）曝光时间三、自显影效率

在制备自显影的过程中，由于非标本放射源而引起乳胶显影的均称本底。

造成自显影本底的原因有：

（1）曝光：红灯过亮（2）过度显影（3）化学假象（4）压力和张力（5）环境辐射和天然本底四、自显影的本底第四节放射自显影技术的应用一、遗传育种研究二、土壤中养分移动研究三、植物营养运转研究四、植物保护研究五、农药残留及环境保护研究

显微放射性自显影与核酸分子杂交及细胞学技术相结合，发展了原位分子杂交技术。即将完整的细胞核染色体，做成细胞学片子，使其中的DNA固定在载玻片上，并保持它们原来的细胞学位置，进行解链处理后，与用同位素标记的和它互补的RNA或单链的DNA溶液杂交，然后进行自显影，可以从中观察到杂交分子在染色上所占的位置。

为了研究不同营养元素在植物中的循环形式，Biddulph等向红菜豆水培液中施入32P、35S和45Ca，吸收1小时后转入非标记的营养液中。然后按一定时间间隔进行自显影。证明在整个96小时的实验期间，有一部分磷仍在继续运转，硫在开始时是活动的，但当它进入幼叶后，活动性就停止了。钙却不同，当它被蒸腾流带入叶子后，就保持在叶中，全不流动。

从植物对寄生物的影响来看，植物中的放射性物质可以进入寄居其上的病菌或害虫。但病菌通过什么组织？在什么时候开始吸收寄主中的养料？用3H-标记的碱基和14C-乳清酸标记寄主后，用非标记的锈病夏孢子接种，证明在吸器形成后才开始吸收，这时寄主中的标记物，通过吸器鞘进入吸器和菌丝体。

浙江农科院和上海原子核研究所对除草丹的研究证明，稗草吸收14C-除草丹的能力比水稻高1-2倍，它主要积累于稗草的叶鞘和茎基中，抑制了叶鞘的生长，造成基部肿疽，最后缺抑制生长，饥饿而死。除草丹抑制了稗草根系对养分的吸收能力和向地上部器官的运转。施药和不施药的相比，其根系吸收32P量相差50%，往地上部运输的32P量相差一倍多，但对水稻的影响较小。课后作业

假设对32P标记的某植物叶片进行放射自显影