第二章显微镜-2-刘甫

第二章显微镜临床检验仪器原理、结构及维修刘甫

医学检验学院免疫学教研室显微镜特殊光学显微镜电子显微镜一、特殊光学显微镜用于某些专门的观察和研究观察普通显微镜看不到或看不清的物体采用特殊的光学技术玛瑙石化木作者：Thomas

Shearer；城市：美国明尼苏达州德卢斯；技术：偏振光彩虹小斑马鱼作者：Albert

Pan；单位：美国哈佛大学；技术：荧光蜗牛齿舌作者：David

Walker；城市：英国西约克郡哈德斯菲尔德；技术：偏振光成年老鼠的海马体作者：Neal

Melvin；城市：美国得克萨斯州达拉斯；技术：荧光星状硅藻类作者：Petr

Znachor；单位：捷克巴德杰维契水生生物研究所；技术：荧光一、特殊光学显微镜特殊光学显微镜暗视场显微镜荧光显微镜倒置显微镜偏光显微镜相称显微镜紫外光显微镜与普通显微镜的区别是照明方式可以分辨0.004μm的微粒（普通只能分辨0.2μm，≤0.1μm者称超显微粒子）只能看到微粒的数量、位置、轮廓和运动状态，无法观察微粒的内部结构暗视场显微镜

Dark-fieldmicroscope用强光照射标本，但是不让强光进入物镜散射光与暗背景之间形成较强的对比进入物镜的是强光在标本上形成的"丁达尔效应"而产生的散射光暗视场显微镜—基本原理丁达尔效应（Tyndalleffect）：当一束光线透过胶体，从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”，这种现象叫丁达尔现象，也叫丁达尔效应（Tyndalleffect）、丁泽尔现象、丁泽尔效应.

暗视场显微镜—基本原理粒子>入射光波长很多倍--光的反射如果粒子小于入射光波长--光的散射

这时观察到的是光波环绕微粒而向其四周放射的光，称为散射光或乳光。丁达尔效应就是光的散射现象对于真溶液，虽然分子或离子更小，但因散射光的强度随散射粒子体积的减小而明显减弱，因此，真溶液对光的散射作用很微弱。散射光的强度，还随着微粒浓度增大而增加，因此进行实验时，胶体浓度不要太稀。由于溶液粒子<1nm，胶体粒子40~90nm<可见光波长（400nm～750nm）产生光的散射现象暗视场显微镜—基本原理丁达尔效应暗视场显微镜—基本原理采用采用特种聚光镜--侧向照明技术透明物体采用环形光阑挡住中间照明不透明物体采用反射光暗视野照明方式同心圆暗场光阑+环形反射镜暗视场显微镜—照明暗视场显微镜—照明荧光显微镜，是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，观察到各种颜色的荧光观察自发光或受激发光样品，或用荧光标记物标记样品，研究荧光物质在组织和细胞内的分布特点：与暗视场形成对比，对比度强可用于观察活体组织的生理或代谢过程用来分析样品的化学组分荧光物质标记后观察荧光显微镜

fluorescencemicroscope荧光显微镜—种类透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜

落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜荧光显微镜--原理某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。荧光显微镜利用特殊的照明装置发出激发光，诱发荧光物质发出荧光，通过物镜作用在样品上，再由目镜观察到肉眼可见的荧光。吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯箱透射荧光显微镜构造透射荧光显微镜原理落射荧光显微镜构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯紫外线保护罩孔径光栏（FS）视场光栏（AS）孔径光阑：决定可以进入光学系统的光束尺寸视场光阑：决定可以观察和成像的视野范围落射荧光显微镜原理荧光显微镜--照明装置常用高压水银灯为光源，光谱峰280~335nm、365~435nm、545~580nm照明方式分透射、落射或组合照明配合专用聚光镜有明场、暗场、偏光和相衬等照明方式荧光显微镜--滤色系统滤色系统由激发滤板和压制滤板组成。

一、激发滤板根据光源和荧光色素的特点可分为三类激发滤板1、紫外蓝光激发滤板：可使300～450nm的光通过。2、紫外蓝光激发滤板：可使300～450nm的光通过。3、紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。二、压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应波长范围的荧光。与激发滤板相对应，可分为三类：1、紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。2、紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上波长的光（绿到红）。3、紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的光（蓝到红）。荧光显微镜--CCD荧光显微CCD：是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品它可以将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过usb接口传输到电脑中，便于图像的采集研究通过荧光显微镜CCD我们可以拍摄到比单纯使用荧光显微镜更好的图片。荧光显微镜CCD可以连接荧光显微镜组成显微成像系统。倒置显微镜

Invertedmicroscope物镜与照明系统颠倒配有长工作距离的聚光镜物镜放大倍数不超过40倍可使用各种培养皿和培养瓶，特别适用于对活体细胞和组织，流质，沉淀物等进行显微研究，常装有摄影（像）装置。倒置显微镜

Invertedmicroscope补充内容光的波粒二象性光到底是什么？……………17世纪明确形成了两大对立学说牛顿惠更斯微粒说波动说由于波动说没有数学基础以及牛顿的威望使得微粒说一直占上风19世纪初证明了波动说的正确性这里的光子完全不同于牛顿所说的“微粒”19世纪末光电效应现象使得爱因斯坦在20世纪初提出了光子说：光具有粒子性

光的微粒说：光是沿直线高速传播的粒子流。

牛顿支持微粒说。人们都认为牛顿是微粒说的代表。牛顿于1675年曾提出：“光是一群难以想象的细微而迅速运动的大小不同的粒子”，这些粒子被发光体“一个接一个地发射出来”。

易解释：光的直进性、影的形成、光的反射和折射等现象。

难解释：（1）一束光入射到两种介质界面时，既有反射，又有折射。何种情况发生反射，何种情况下又发生折射呢?微粒说在解释这一点时遇到了很大的困难。（2）两束光相遇后，为何仍能沿原方向传播这一常见的现象，微粒说则完全无能为力了。光的波动说：某种振动，以波的形式向四周围传播。代表人物：是荷兰的物理学家惠更斯。易解释：（1）光的反射、折射、光的反射和折射可以同时发生。（2）两束光相遇后，为何仍能沿原方向传播这一常见的现象。难解释：光的直进性和影的形成。干涉现象：英国医生兼物理学家托马斯·杨于1801年进行了著名的杨氏干涉实验。衍射现象：法国工程师菲涅耳于1818年演示了小孔衍射。干涉和衍射是波动的重要特征，从而光的波动说得到迅速发展。人类对光的本性的认识达到一个新的阶段。

电磁说的提出：随着物理学各方面的发展，麦克斯韦提出了电磁波的理论，进而完善了光是电磁波的结论，惠更斯的波动说发展到了麦克斯韦的电磁说。干涉现象：是波动独有的特征，只有两列频率相同，相位差恒定，振动方向一致的相干光源在空间相遇时相互叠加，才能在某些区域始终加强，在另一些区域则始终削弱，形成稳定的强弱分布的现象--光的干涉。衍射现象：光绕过障碍物偏离直线传播路径而进入阴影区里的现象，叫光的衍射。光电效应：19世纪末，光电效应被发现，光的波动说在光电效应面前束手无策，人们又认识到了光确实具有粒子性。爱因斯坦提出了光的量子理论---光子说.人们终于认识到光既具有波动性又具有粒子性。光的波粒二象性光电效应和康普顿效应表明光具有粒子性，光的干涉、衍射、偏振现象表明光具有波动性。光既有粒子性，又有波动性，单独使用波或粒子的解释都无法完整描述光的所有性质，人们把这种性质称为波粒二象性光子是能量为hν的微粒，表现出粒子性，而光子的能量与频率ν有关，体现了波动性，所以光子是统一了波粒二象性的微粒。但是，在不同条件下的表现不同。大量光子表现出波动性，个别光子表现出粒子性；光在传播时表现出波动性，而在与其他物质相互作用时表现出粒子性；频率低的光波动性更强，频率高的光粒子性更强。综上所述，光的粒子性和波动性组成一个有机的统一体，并不是独立存在的。光的粒子性:1.与物质发生作用时,表现出粒子的性质2.少量或个别光子容易显示出粒子性3.频率较大时,易显示粒子性光的波动性:1.传播时,表现出波的性质2.大量光子容易显示出波动性3.频率较小时,易显示波动性正确理解波粒二象性偏光显微镜

polarizingmicroscope利用光的偏振特性对组织内含有的具有双折射特性的晶体类物质进行观察需要专门的偏振片（起偏片）将入射光变为偏振光载物台分为两层，上层可旋转，下层设有游标，可分辨0.1º的转角检测偏振光需要与上述相同的偏振片（检偏片）

偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。偏光显微镜

偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。偏光显微镜偏光显微镜

偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。偏光显微镜的结构光通过单轴晶体时的双折射现象一.双折射现象：1.双折射：当一束光在各向异性介质折射时，折射光一般将分为两束，这种现象称为晶体的双折射2.双折射现象的特点和规律：当一束自然光正入射到冰洲石（或碳等）晶体界面上时，在晶体内部分成两束折射光，一束总是满足折射定律称寻常光（o光），另一束不满足折射定律，称为非常光（e光），双折射后的偏振光都是线偏振光，并且振动方向相互垂直。双折射现象对于各向异性晶体，一束光射入晶体后，可以观察到有两束折射光的现象。n1n2irore(各向异性媒质)自然光寻常光线(o光)-----遵守折射定律非常光线(e光)-----不遵守折射定律o光和e光都是线偏振光。一、自然光一束自然光可以等效为:光振动方向相互垂直的、等振幅的、互不相干的、光强度各占一半的两束光。自然光的等效由于光源发光是由大量原子发光组成,每个原子发光的电矢量和磁矢量的振动方向都是随机的,

和

在各方向的振动都存在;感光作用决定于电矢量

(光矢量),且的振幅可看作完全相等.自然光的图示法：自然光自然光的等效二、线偏振光(完全偏振光)只在某一方向有光振动的光，称为线偏振光。E播传方向振动面·面对光的传播方向看线偏振光可沿两个相互垂直的方向分解EEyEx

yx线偏振光的表示法：光振动垂直画面光振动平行画面

某些物质能强烈地吸收某个方向的光振动，当自然光照射其上时，只允许某个特定方向的光振动通过，形成偏振光。起偏和检偏一、起偏从自然光获得偏振光的过程，称为起偏。起偏器:产生偏振光的光学器件.偏振片:只能透过某一方向光振动的光学器件.二、检偏用偏振片分析检验光的偏振态过程.I?P待检光旋转法.9......起偏器检偏器自然光线偏振光偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....起偏器检偏器自然光线偏振光偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....起偏器检偏器自然光线偏振光偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....起偏器检偏器自然光线偏振光两偏振片的偏振化方向相互垂直光强为零偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....起偏器检偏器自然光线偏振光偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....起偏器检偏器自然光线偏振光偏振光通过旋转的检偏器，光强发生变化.....检偏器自然光通过旋转的检偏器，光强不变自然光.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变.....检偏器自然光自然光通过旋转的检偏器，光强不变相衬显微镜

光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见。活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。

相衬显微镜比普通光学显微镜多了2个部件：在聚光器上增加一个环形光阑；在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后1/4λ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。相衬显微镜相衬显微镜照明原理

光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了1/4λ。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的1/4λ的光程差。两组光在平面上成像。相衬显微镜

如果相板的环形区使直射光超前1/4λ，加上开始直射光超前的1/4λ，直射光共超前1/2λ，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。如果相板的环形区使直射光滞后1/4λ，加上开始直射光超前的1/4λ，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。相衬显微镜紫外光显微镜

紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（ultravioletmicroscope）研究单个细胞的组成与变化情况。二、电子显微镜一、电子显微镜的基本结构二、电子显微镜的分类及其应用

光镜分辩极限为0.2m，小于0.2m的微细结构的光波可产生衍射现象,这种光波经过物体时可绕过物体就象无物体经过一样,因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比0.2m更小的物体的微细结构。

一、电子显微镜的基本结构电子光学系统真空系统供电系统机械系统观察显示系统照明系统成像系统（一）电子光学系统---照明系统电子光学系统主要由电子枪和聚光镜组成。电子枪是发射电子的照明光源。聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。

1.电子枪

电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子光源。常用的电子枪是热阴极三极电子枪，它由发夹形钨丝阴极、栅极和阳极组成。电子枪的结构及工作原理图灯丝2.聚光镜

聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小的损失照明样品，调节照明强度、孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜系统。第一聚光镜是强激磁透镜而第二聚光镜是弱激磁透镜。（一）电子光学系统——成像系统

电子透镜：能使电子束聚焦的装置电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。电子透镜存在各种像差（aberration），这是影响成像质量的主要因素。电子透镜(二)真空系统

主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。(三)供电系统

供电系统包括