第3章 细胞工程

第三章细胞工程细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。第一节细胞工程的基础知识与基本技术一细胞工程的兴起和基本内容

细胞工程是在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程。细胞工程应用的原理和方法细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品概念分类植物细胞工程研究的目的研究的水平动物细胞工程细胞工程的概念二细胞工程的主要成就1植物细胞工程可以获得大量的次生代谢物质；使传统的作物育种实现工厂化；植物花药培养和单倍体育种技术具有重要的应用价值。2动物细胞工程动物胚胎移植，使牲畜快速良种化；单克隆抗体技术也是动物细胞工程的重大贡献；动物细胞工程技术在生物制药领域发挥了巨大作用。3微生物细胞工程在生物药品生产上的应用:生产抗生素、生物活性物质、疫苗等在环保中具有重要作用：消除环境中的有害废物或变废为宝三细胞工程的基础和基本操作

细胞原核细胞真核细胞原核细胞和真核细胞的区别?基本操作：无菌操作细胞培养技术细胞培养是指动植物或微生物的细胞在体外无菌的条件下的保存和生长。细胞培养的应用：1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2.直接观察细胞的变化可便于摄影。3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。6.易于施用物理、化学生物的实验研究。7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。细胞培养的流程一、准备工作

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

细胞融合技术细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程称细胞融合。细胞融合的过程：制备原生质体：植物细胞壁（纤维素酶等）诱导细胞融合：PEG或其他的诱导剂筛选杂合细胞：第二节植物细胞工程一植物组织培养定义：组织培育是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）的条件下，培养植物组织或器官，从中分化发育出整体植株的技术。理论基础：植物细胞具全能性进行植物组织培养的5个阶段：1预备阶段：（1）选择合适的外植体外植体：能被诱导产生无性增殖系的器官或组织切段（2）除菌：

（1）刷洗或冲洗外植体材料。（2）在超净工作台上用已消毒的烧杯、镊子和消毒剂操作。一般先用70％酒精浸泡30～60s，再用其他消毒剂。（3）然后，无菌水反复冲洗三四次。（3）配制适宜的培养基：①基本成分：无机盐（大量元素）和有机化合物（如糖类，氨基酸、酰胺类、维生素类、肌醇、天然营养物等）。②微量无机物－－微量元素③微量有机物，包括生长素和细胞分裂素pH值常为5.6～6.0

生长素类包括：

吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（IBA）萘乙酸（NAA）

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）

细胞分裂素包括：

6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）（又名激动素，6-糠基氨基嘌呤）

6-苄基腺嘌呤（6BA）玉米素（ZT）赤霉素类（GA)

生长素细胞分裂素愈伤组织胚根、胚芽

（1）接种：每瓶约4～10个（2）封口（3）培养条件：温度为25℃左右光照为1000～4000lx

相对湿度保持在70～80%，

接种和培养：2诱导去分化阶段分化：是导致细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程；去分化（脱分化）：是指已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂机能并改变原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程激素要求：较高的生长素/细胞分裂素3继代增殖阶段愈伤组织长出4-6周水分和营养成分消耗有害物质积累移植把愈伤组织切割后转入增殖培养基。一般一个月左右增殖培养一次。4生根发芽阶段愈伤组织胚状体小植株胚状体：是指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造

需要条件:

(1)增加细胞分裂素浓度，减少生长素浓度；

(2)光照

外植体↓高浓度生长素（2,4-D）

脱分化↓愈伤组织↓高（细胞分裂素/生长素）

再分化↓形成芽↓低（细胞分裂素/生长素）

分化根↓完整植株

激素控制器官分化模式图5移栽成活阶段试管苗人工气候室大田

植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。二植物细胞培养和次生代谢物的生产

酚类化合物－黄酮类、单酚类、醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）；萜类化合物－三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜；含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）；胺类（伯、仲、叔、季胺）、生氰甙、多炔类以及有机酸等。

植物次生代谢产物根据分子结构的不同可以分为：1植物细胞悬浮培养愈伤组织、无菌苗、胚或外植体破碎过滤振荡培养试管或培养瓶单细胞滤液悬浮培养方法：有分批培养法、半连续培养法、连续培养法悬浮培养的特点：细胞生长快，次生代谢物含量低。2固定化植物细胞培养细胞固定化：将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在表面细胞分化和次生代谢物积累之间存在正相关性。细胞固定化后有利于细胞的分化和组织化，有利于次生代谢物的合成。固定化细胞培养特点：细胞生长慢，次生代谢产物含量高。三植物原生质体的制备与融合原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。细胞原生质体酶解体细胞融合遗传转化共培养显微操作基因枪导入原生质体培养细胞培养愈伤组织诱导再生植株1.原生质体研究概况2植物原生质体的制备***原生质体分离的要求：产量高、活性强，能够进行分裂诱导形成愈伤组织或胚状体，植株再生。***1960年英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄幼苗根尖细胞获得原生质体，从而开创用酶解法分离植物原生质体的新时期。***早期分离方法－－－机械分离法（易破碎、获得率低）***目前使用的降解酶：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（1）取材与除菌外植体包括：幼根、嫩叶、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞及悬浮培养细胞等。除菌：方法同组培。（2）酶解①配制酶解反应液:pH5.5－5.8,0.3%～3.0%的纤维素酶、渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等②酶解：除菌后的材料切小块放入酶解反应液→反应液变绿（3）分离:沉降法和漂浮法沉降法：渗透压溶液过滤40-100um的筛网滤液除去大的组织块和残渣离心上部溶液下部沉淀加入新鲜培养基离心（4）洗涤用新高渗溶液或原生质体培养基进行离心洗涤2-4次（5）鉴定：低渗膨胀法、荧光染色法

在低渗溶液中，真正的原生质体，破裂后会消失；如果原生质体还带有部分细胞壁，破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。低渗膨胀法：荧光染色法：含有0.7mol/L甘露醇的0.05%～0.1%荧光增白剂溶液，染色5-10min，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光显微镜下观察。绿色光显示纤维素的存在，发出红色光的是原生质体。原生质体活力检测：①形态识别法：体积能随介质渗透压变化而改变的，都是活的原生质体②胞质环流法：有胞质环流的是活原生质体；③染色法：荧光素双醋酸酯、台盼蓝等染色④氧电极法：氧电极测定氧浓度的变化来判定原生质体是否具有活力诱导体细胞融合的方法主要有：聚乙二醇（PEG）高钙高pH值法（Kao，1977）。电融合法（Zimmermann，1982）三植物原生质体的制备与融合3植物原生质体融合（1）化学诱导融合：PEG双亲原生质体PEG摇匀，静置摇匀，静置高钙高pH溶液培养液洗涤离心原生质体再生杂合细胞筛选化学诱导融合的优缺点：优点：无需贵重仪器，试剂易得；融合子产生的异核率较高缺点：融合过程繁琐，PEG对原生质体有一定的毒性。（2）物理法诱导融合：电击融合双亲原生质体悬液插入电极接通交变电场原生质体极化原生质体紧密接触施加瞬间脉冲质膜击穿，融合细胞膜的接触膜的击穿不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融合技术操作简便；可在显微镜下观察或录像融合过程。电融合法与PEG融合法相比具有的优点：4杂合体的鉴别与筛选（1）杂合细胞的显微镜鉴别（2）互补法筛选杂合细胞前提：用于杂交的是各种遗传突变细胞株A细胞：KmRAPH

×B细胞：KmHAPR

AB杂合细胞KmRAPR

细胞融合（3）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体染色体核型分析染色体显带分析核酸分子杂交DNA分子标记技术（RFLP,AFLP,RAPD等）（4）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别番茄×

马铃薯杂交植株形态象马铃薯，果实象番茄，高度不育细胞融合因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。于是，科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。植物体细胞杂交技术这幅图中的植物利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？植物体细胞杂交的概念

将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。植物体细胞杂交的原理：（1）细胞膜的流动性（2）细胞的全能性相关问题（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？（2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？（3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？（4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？（5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？植物体细胞杂交过程植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁（细胞融合完成的标志）杂种细胞（筛选）细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株融合植物组织培养去壁物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）等试剂纤维素酶、果胶酶等杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的染色体是两亲本细胞染色体之和。

意义

与有性杂交（种内）相比，植物体细胞杂交克服了远缘杂交不亲合的障碍，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围（种间、属间），并且培育出了许多在生产上有较高应用价值的杂种植株品种。烟草——

海岛烟草胡萝卜——

羊角芹四单倍体植物的诱发与利用单倍体植物：具有单套染色体的植物体。诱导植物单倍体主要有4种途径：人工诱导单倍体是指单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其发育成单倍性植物体。第三章细胞工程第二节植物细胞工程1花药培养原理：花粉囊中的花粉经过适当的诱导，可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终形成花粉植株。花药培养的不足：双倍体植株所占百分比过高；白化苗较多。（1）选取成熟度适中的花蕾或幼穗；（2）花药预处理;（3）选择适当的培养基与培养条件。花粉植株的诱导：2花粉培养优点：诱导的植株全部为单倍体植株；不足：白化苗较多。3未授粉胚珠的培养1976年，Noeum从大麦未授粉子房获得单倍体植株。优点：诱导的植株大多数是单倍体绿苗；不足：该领域的工作目前开展得不多。4杂交法获得单倍体植株原理：杂交，特别是远缘杂交，杂种胚在胚胎发育过程中往往会将一方亲本的染色体逐步排除，最终将得到仅含一方染色体的单倍体植物。优点：长出的植株都是绿苗。5.单倍体培养物的染色体加倍：诱导单倍体培养物的目的：是为了对其进行染色体加倍，从而获得“纯系”二倍体植物。诱发单倍体植株的各个阶段（愈伤组织、幼胚和植株）常规途径培养二倍体植株0.2%～0.4%秋水仙素处理24～48h染色体加倍五人工种子的研制人工种子:人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。1人工种子的构成及特点人工种皮人工胚乳胚状体人工种子2人工种子的制备

（1）胚状体的制备及其同步生长;**获得体细胞胚是生产人工种子的基础，其发生频率的高低、胚的质量和体细胞胚发生的同步控制是生产人工种子的关键。

细胞、组织培养的培养基＋天然大分子碳水化合物＋激素、抗生素、农药、除草剂（2）人工胚乳的制备;（3）配制包埋剂及包埋。3人工种子的贮存与萌发保存：低温，4-7C；干燥，相对湿度小于67%第三节动物细胞工程一动物组织及细胞培养1.动物组织培养法无菌取出目的组织切成组织小块加培养基翻转培养瓶180°15-30min使组织块贴壁生长翻回培养瓶37℃静置培养2.细胞培养法无菌取出目的组织切成小块将小组织块放在含蛋白酶类的解离液中离散细胞低速离心收集细胞洗涤转移到培养容器中培养人的细胞培养：大量培养动物细胞的三种方法：（1）微导管培养法；（2）微载体培养法；（3）微胶囊培养法。3培养物的传代4无血清培养无血清培养基：包括基础培养基，基质因子和生长因子、激素和维生素等约30种有机和无机微量物质第三节动物细胞工程无血清培养基的附加成分：5培养物的长期保存：经典传代法、冷冻保存法冷冻保存法：培养物与5%－10%的甘油或二甲亚砜混匀分装于若干个耐低温容器降温到-30℃降温度降到－150℃转移到液氮中冻存1-3℃/min15-30℃/min6.动物组织、细胞培养污染的防治污染源：微生物污染、不同细胞株之间的交叉污染二动物细胞融合动物细胞融合的途径有三条：1.病毒诱导融合双亲本细胞分别制成细胞悬液混合离心收集双亲细胞沉淀混匀细胞凝集细胞融合选择培养基培养灭活仙台病毒悬液冰浴20min间歇摇动水浴37℃30min间歇摇动第三节动物细胞工程人、鼠细胞融合3.电激诱导融合2化学诱导融合同植物原生质体融合三单克隆抗体技术1免疫系统免疫系统三道屏障皮肤非特异性免疫特异性免疫细胞免疫：不产生抗体体液免疫：产生抗体体液免疫的特征：机体产生了针对浸入细菌的抗体。抗原决定簇抗体：是由体内一种免疫细胞即B淋巴细胞分泌产生的特殊蛋白质，能专一性识别细菌表面的特殊化学结构。2抗原和抗体抗原（antigen）：进入动物体内诱发抗体产生的外源物质抗原的特性：从未接触过的外源异物分子表面有稳定的结构基团作为识别位点相对分子量愈大，抗原性愈高抗体与抗原间的反应是特异的3B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术克隆选择理论：一种B淋巴细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子，从一个单克隆细胞产生的抗体分子就是单克隆的，这种单克隆抗体具有独特的均一结构（1957年，Burnet）。1975获得了由一个克隆产生的抗体即单克隆抗体杂交瘤B淋巴细胞（免疫小鼠脾细胞）：骨髓瘤细胞（小白鼠的骨髓瘤细胞）：产生抗体，但不能体外增殖不能产生抗体，可体外无限增殖3B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术产生B淋巴细胞杂交瘤的技术过程：四细胞核移植与动物克隆1.细胞核移植核移植技术：是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性系杂交生物新品种的一项技术。2.开展细胞核移植的目的：（1）异种细胞核质之间的遗传相互关系研究；鱼移植鲤鱼囊胚期细胞核鲫鱼去核受精卵检测形态：口、须、咽像鲤鱼，脊椎骨数目像鲫鱼，侧线鳞片数为中间类型分子鉴定：血清和血红蛋白的电泳分析杂种鱼发育（2）脊椎动物克隆――细胞核遗传全能性研究。是否具有遗传全能性？处于个体发育各个时期、履行不同职责的细胞，它们细胞核的遗传潜能是否一样？Briggs在1952年的实验：蛙囊胚期细胞核克隆蛙成功；而胚胎发育后期、蝌蚪期及成蛙的细胞核克隆失败。

胚胎发育后期及成体细胞核不具全能性尚未分化已分化1981年Illmenses用小鼠幼胚细胞核克隆出小鼠

1986年Willadsen等用早期羊胚胎细胞核克隆出羊

1964年南非科学家Gurdon取得了突破

体细胞克隆终于在1997年取得重大突破

胚胎早期细胞核具全能性Gurdon（

1964）：非洲爪蟾蝌蚪肠壁细胞核移植试验

；Wilmut（1997）：利用6岁绵羊乳腺细胞成功克隆出“多莉羊”

到目前为止，用体细胞克隆技术已成功克隆出小鼠、牛、山羊、绵羊、猪、兔、猫、猴子、骡子、马等动物。

动物的体细胞核具有遗传全能性英国罗斯林研究所的维尔穆特成功克隆了多莉羊（Nature,1997,

385,810–813）。多利羊的产生过程：芬兰多塞特白脸绵羊苏格兰黑脸绵羊

苏格兰黑脸母绵羊

多莉为白脸绵羊重复227次29个异核卵发育到囊胚期植入13只代孕母羊子宫只产下一只羊羔3.体细胞克隆的影响和意义：①遗传素质完全一致的克隆动物更有利于开展对动物包括人的生长、发育、衰老和健康等机制的研究；②有利于大量培养品质优良的家畜；③经转基因的克隆哺乳动物，将能够为人类提供廉价药品及易为人体接受的器官；④从同种克隆技术探索异种克隆，将极大地促进濒危哺乳动物的保护工作。4.关于克隆人基于动物克隆的发展，克隆人已成为可能支持者认为：克隆人是科学的巨大进步反对者认为：克隆人类，将会导致一系列伦理、道德和社会问题；学术界也持反对态度，认为克隆人是遗传上的退化。五染色体转移细胞间遗传信息转移转基因细胞融合染色体转移微细胞介导法直接转移法1.微细胞介导法

微细胞：是指只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞膜的核质体

微细胞制备：秋水仙素处理，CB与离心并用脱核微细胞制备示意图微细胞介导的染色体转移：2直接转移法

制取供体细胞染色体的步骤：供体细胞秋水仙素低温处理细胞破碎高速离心收集染色体

染色体向受体细胞转移的方法：①直接用微注射针向胞内注射染色体悬液；②染色体与细胞共培养，使其以胞吞方式进入细胞；③将染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞上；④用脂质体包裹染色体，再经聚乙二醇介导融合。六干细胞研究

在20世纪50年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）干细胞（stemcell）：是动物包括人胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官的种子细胞。

3种干细胞类型：全能性干细胞：即胚胎干细胞，具有自我更新、高度增值和多向分化发育成为人体各种器官、组织、细胞，甚至形成完整个体的能力；多能性干细胞：具有分化出多种细胞、组织的潜能，但不具备发育成完整个体的能力；专一性干细胞：只能分化出一种或功能相关的两种细胞。干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。干细胞的特点具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分离的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。1.胚胎干细胞具有正常、完整(双倍体)及稳定的染色体核型。2.胚胎干细胞的形态学表现为体积小，核大，胞质少，有1或2个核仁，细胞与细胞紧密聚集在一起，细胞间界限不清晰，呈集落型生长，形状似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。3.胚胎干细胞可以表达早期胚胎细胞特异表达基因，如碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)基因，高端粒酶基因活性。4.胚胎干细胞具有无限增殖的能力。5.胚胎干细胞具有广泛体外的分化能力。6.胚胎干细胞具有广泛的体能分化能力。7.胚胎干细