第2章-色谱基本理论

第二章色谱法原理

（PrinciplesofChromatography）2-1概述

色谱法早在1903年由俄国植物学家M.Tswett（茨维特）提出，成为十分重要的分离分析手段。实验：叶绿素分离：石油醚浸提叶片——碳酸钙填充拄——纯净石油醚淋洗———叶绿素分离（a，b，叶黄素，胡萝卜素）“色谱”（Chromatography层析法）概念的产生色谱法共同的基本特点色谱法共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称为固定相(色谱柱)；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相（载气或流动相）。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出（洗脱）。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础主要色谱仪器及基本工作流程气相色谱仪：气路系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、温控系统（柱温箱）、检测系统（检测器和数据处理系统）组成。液相色谱仪：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测及数据处理系统色谱法分类

2.2.1按两相状态分类

气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）．液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。其中，在色谱柱制作技术中通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。

2.2.2按分离机理分类

利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或排阻色谱法。利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。

固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。

根据以上所述，将色谱法的分类总结于表2-l中。2.2.3按固定相的外形分类

2-12-2色谱流出曲线及有关色谱术语2.2.1流出曲线和色谱峰

2-1试样中各组分经色谱柱分离后，以此流出色谱柱，经检测器转换为电信号，然后用数据记录装置将各组分的浓度变化记录下来，即得色谱图。色谱图是以组分的浓度变化引起的的电信号作为纵坐标，流出时间作为横坐标的，这种曲线称为色谱流出曲线。其它色谱术语基线(Baseline)、基线噪声(Baselinenoise)基线漂移(Baselinedrift)死时间(Deadtime)、死体积(Deadvolume)保留值(Retentionvalue):

Retentiontime&Retentionvolume调整保留值(Adjustedretentionvalue)：Adjustedretentiontime&Adjustedretentionvolume相对保留值(Relativeretentionvalue)区域宽度(Peakwidth)

标准偏差(Standarddeviation)

半峰宽度(Peakwidthathalf-height)

峰底宽度(Peakwidthatpeakbase)

峰高（Peakheight）2.2.2基线

柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图2-1中O—t线．理想的基线应该是一条水平直线。基线噪声，基线漂移

2-12.2.3峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图2-1中B′A

2.2.4保留值（1）死时间tM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图2-1中O′A′。

因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算。

（2）保留时间tR

试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图2-1O′B．它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间．

图2-1色谱流出曲线（3）调整保留时间tR′

某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即

tR′=tR-tM

由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停留的总时间．保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。保留时间是色谱法定性的基本依据。但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等进行定性检定。

（4）死体积VM

色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和．当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（L／min）计算：

VM=tM·F0

（5）保留体积VR

从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：

VR=tR·F0

（6）调整保留体积VR′

某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即VR′=VR-VM

（7）相对保留值γ2.1

某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：

由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据．

必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.*选择因子

式中tR2′为后出峰的调整保留时间，所以这时α总是大于1的。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值．在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示：2.2.5区域宽度

色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：

（1）标准偏差σ：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图2-1中EF距离的一半。（2）半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，如图2-1中GH间的距离。它与标准偏差σ的关系是：

Y1/2=2.354σ2-1

（3）基线宽度（W或Y）

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图2-1中IJ的距离。它与标准偏差的关系是：

Y=4σ

色谱流出曲线可以得到许多重要信息：

（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值(位置），可以进行定性分析。（3）根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。

2-3色谱法分析的基本原理

色谱分析根本目的：将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远.

两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。

2.3.1分配系数K和分配比k（1）分配系数K

色谱分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配或吸附--脱附过程（溶解）。分配系数是描述分离过程中样品分子在两相间分配的参数，它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值（2）分配比k

分配比又称容量因子：它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质，不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。

式中CS、Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比k值的计算（直接从色谱图测得）

滞留因子(保留比)Rs设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以us＜u．此两速度之比称为滞留因子Rs。

对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为Rs若用质量分数表示，即整理式上述公式，可得

通过色谱流出曲线,就可求得分配比k.2-1（3）分配系数K与分配比k的关系

其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如：填充柱：6～35；毛细管柱：60～600。

分配系数是组分在两相中的浓度比,分配比是组分在两相中分配总量之比.热力学性质(拄温,柱压)分配系数只取决与组分和两相性质,与两相体积无关,而分配比不仅取决与组分和两相性质,还与相比有关.一定的色谱体系中,组分分离决定于组分在每相中的相对量,而不是相对浓度,因此,分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数.k越大,保留时间越长,k为0,保留时间为死时间.（4）分配系数K及分配比k与选择因子α的关系

对A、B两组分的选择因子，用下式表示

上述公式表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。2.3.2塔板理论最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。

（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。理论假定：

为简单起见，设色谱往由5块塔板（n＝5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2…，n－l；某组分的分配比k=1根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0．5，其中气液（或气固）两相各为0．25而1号板上所含总量同样为0．5．气液（或气固）相亦各为0．25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。

表2-1组分在任一板上的分配情况由塔板理论可建流出曲线方程：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当V=Vr时，C值最大，即由流出曲线方程可推出：

而理论塔板高度（H）即：

从上两式可以看出，色谱峰Y越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。通常填充色谱柱的n＞103，H＜1mm。而毛细管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死时tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽大,H很小,但与实际柱效能相差甚远.所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。注意:同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的,当用这些指标表示柱效能时,必须说明是对什么物质而言.塔板理论基本公式的意义成功之处：塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。

局限：由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用色谱柱n越大,表明组分在色谱柱中达到分配平衡的次数就越多,固定相的作用就越显著,对分离就越有利!但还不能预言并确定各组分能否被分离(能否分离决定于试样混合物中在固定相中的分配系数的差异,而不是分配次数差异),因此不能把n有效作为能否实现分离可能的依据,而只能看作是一定条件下柱分离能力发挥程度的标志.本节主要概念和重要公式调整保留时间tR′=保留时间tR-死时间tM

相对保留值γ2.1（选择因子α）分配系数K与分配比k

与选择因子α的关系理论塔板数n与保留时间tR和半峰宽Y1/2、峰宽Y的关系理论塔板高度H2.3.3速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。

VanDeemter方程的数学简化式为

式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。(1)涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如图18S1所示。

A＝2λdp上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A＝0。

(2).分子扩散项B/u(纵向扩散项)

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为

B＝2γDg式中γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况,Dg为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）。I气相色谱中影响B项的因素（1）组分保留时间：保留时间长，色谱峰扩张就越显著（2）载气性质：载气分子质量大，Dg小，Dg反比于载气密度的平方根或载气相对分子质量的平方根。采用相对分子量较大的载气（氮气），可使B项降低，Dg随柱温增加而增加，反比于柱压。（3）弯曲因子γ

γ：填充物的存在造成扩散阻碍而引入的的校正系数。λ：是填充物的不均匀性造成的。II液相色谱的纵向扩散项当试样分子在色谱柱中被流动相携带前进时，由分子本身运动所引起的纵向扩散项同样引起色谱峰的扩展。它与分子在流动相中的扩散系数Dm成正比，与流动相的线速u成反比。

由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4-5个数量级，因此在液相色谱法中当流动相线速度大于0.5cm.s-1。可忽略纵向扩散项的影响。(3)传质阻力项C·u

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同.传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即C＝Cg＋Cl

I气液色谱这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程.对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为

式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数成反比。采用粒度小的填充物相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。液相(气液色谱的固定相)传质阻力系数Cl为

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。

将上式总结，即可得气液色谱速率板高方程

这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。

传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即

C＝Cm＋Cs

II液液分配色谱Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即

式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀.ωm是由柱和填充的性质决定的因子。ωsm是常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。

液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：上式可见，对固定相的传质所引起的峰扩展，主要从改善传质，加快溶质分子在固定相上的解吸过程，着手加以解决。对液液分配色谱法，可使用薄的固定相层，而对吸附、排阻和离子交换色谱，则可使用小的颗粒填料来解决，使用具有扩散系数大的固定液，亦可改善传质。

该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为：

（4）流动相线速度u对板高的影响

LC和GC的H－u图表明，对于一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。

但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？

根据vanDeemter公式分别作LC和GC的H－u图由图a不难看出：LC和GC的H－u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多;LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献

（5）固定相粒度大小对板高的影响

固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度，H－u曲线也不同（见右图）：

粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。小结？课后思考：如何利用速率理论公式阐述提高色谱分离效率的方法（H减小）气液色谱速率板高方程液液色谱速率板高方程2-4色谱分析条件的选择2.4.1分离度一个混合物能否为色谱柱所分离，取决于固定相与混合物中各组分分子间的相互作用的大小是否有区别。但在色谱分离过程中各种操作因素的选择是否合适对于实现分离的可能也有很大的影响。因此在色谱分离过程中，不但要根据所分离的对象选择适当的固定相，使其中各组分有可能被分离，而且还要创造一定的条件，使这种可能性得以实现，并达到最佳的分离效果。图中（a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。柱效和选择性对分离的影响由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引入一个综合性指标——分离度R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般定义为当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1时，分离程度可达98％；当R＝1.5时，分离程度可达99.7％。

通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。

不同分离度时色谱峰分离的程度。例题从色谱图上测得组分x和y的保留时间分别为10.52min和11.36min,两峰的峰底宽为0.38min和0.48min,判断两峰是否达到完全分离?解：根据色谱分析中分离度（R）定义及计算公式：由于1.95>1.5，故x,y两组份能分离。

2.4.2色谱分离基本方程

分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度受柱效（n）、选择因子(α)和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1≈k2=k,Y1≈Y2＝Y。由塔板理论公式和上式，得（PP:18）后式即为基本色谱分离方程式

在实际应用中，往往用neff。代替n,处理上式可得

可以看出，后者为基本色谱分离方程式又一表达式。

2.4.3分离操作条件的选择（1）分离度与柱效的关系

由分离方程式看出，具有一定相对保留值α的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的α确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。

由基本色谱方程式判断，当α=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，α大，选择性好。研究证明，α的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大α值。

（2）分离度与选择因子的关系（3）分离度与容量因子(k)的关系如果设：则分离方程式写成

由R/Q－k的曲线图看出：当k＞1O时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为2～10最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k值，以改进分离度。对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果（见图18d4）。

液相色谱分析通过改变流动相组成改变分离度

（4）分离度与分析时间的关系

下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。分析时间与分离度呈正相关关系，且为指数关系，分离度越大，所需分析时间越长。（5）基本色谱分离方程式的应用

在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。

［例2-1］有一根lm长的柱子，分离组分1和2得到如图18d5的色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到R=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？解：先求出组分2对组分1的相对保留值r2，1（即α值）求有效塔板数neff

neff＝16×（0.8）2[1.1/(1.1-1)]2＝1239若使R=1.2,所需塔板数可计算,即因此,欲使分离度达到1.2,需有效塔板数为2788块,则所需柱长为L=2788/1329×1m=2.25m[例2-2]已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm,求两峰的半峰宽和分离度.

解:∵w1/2=w/1.7w1=27/(3600/16)1/2=1.8mm(w1)1/2＝1.8/1.7＝1.06mmw2=30/(3600/16)1/2=2.0mm(w2)1/2＝2.0/1.7＝1.18mmR＝2(30-27)/(1.8+2)＝6/3.8＝1.6[例2-3]已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.40和17.63分钟.不被保留组分通过该柱的时间为1.30分钟.峰宽为1.11和1.21mm,计算:

(1)

柱分辨本领(R);

(2)

柱的平均塔板数目(n理论);

(3)

塔板高度(H);

(4)

达到1.5分离度所需的柱长度;

(5)在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间.

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16(16.40/1.11)2=3493nB=16(17.63/1.21)2=3397nav=(3493+3397)/2=3445=3.44×103(3)H=L/n=30.0/3445=8.708×10-3cm=8.71×10-3cm(4)n2=3445×2.25/1.124=6.90×103

源于n1/n2=(R1/R2)2L=nH=6.90×103×8.71×10-3=60.1cm(5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.63×1.52/1.062

=35.3分钟2-5色谱的定性分析与定量分析

2.5.1色谱定性分析色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非专属的。仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表的化合物。（1）用已知纯物质对照定性

这是色谱定性分析中最方便，最可靠的方法。这个方法基于在一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值的原理。

如果未知样品较复杂，可采用在未知混合物中加入已知物，通过未知物中哪个峰增大，来确定未知物中成分。纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物。（2）用经验规律和文献值进行定性分析

当没有待测组分的纯标准样时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。

①碳数规律大量实验证明，在一定温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中碳原子数成线性关系，即式中A1和C1是常数，n为分子中的碳原子数（n≥3）。该式说明，如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其它组分的调整保留值。

例：菜籽油或动物脂肪中脂肪酸的测定（甲酯化后）

②沸点规律

同族具有相同碳数碳链的异构体化合物，其调整保留时间的对数和它们的沸点呈线性关系，即式中A2和C2均为常数，Tb为组分的沸点（K）。由此可见，根据同族同碳数碳链异构体中几个已知组分的调整保留时间的对数值，可求得同族中具有相同碳数的其他异构体的调整保留时间。例：666，DDT气相色谱图（3）根据相对保留值定性有时利用相对保留值定性比用保留值定性更为方便、可靠。在用保留值定性时，必须使两次分析条件完全一致，有时不易做到。而用相对保留值定性时，只要保持柱温不变即可。这种方法要求找一个基准物质，通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。（4）根据保留指数定性

保留指数又称Kováts指数，是一种重现性较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。

保留指数也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为n100。被测物的保留指数值可用内插法计算。

内插法求IiX示意图信号tR(Z)

tR(i)

tR(Z+1)

t进样［例3-4］图2-19为乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲线（柱温100℃）。由图中测得调整保留距离为：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正丁酯的保留指数。

即乙酸正丁酯的保留指数为775.6。在与文献值对照时，一定要重现文献值的实验条件，如固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。解：已知n=7（5）双柱、多柱定性

对于复杂样品的分析，利用双柱或多柱法更有效、可靠，使原来一根柱子上可能出现相同保留值的两种组分，在另一柱上就有可能出现不同的保留值。

（6）与其他方法结合

色谱与质谱、Fourier红外光谱、发射光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一。2.5.2定量分析

色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的面积或峰高，计算样品中溶质的含量。

（1）峰面积测量方法

峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。①对称形峰面积的测量--峰高乘半峰宽法理论上可以证明，对称峰的面积

A=1.065×h×W1／2

②不对称峰面积的测量--峰高乘平均峰宽法对于不对称峰的测量如仍用峰高乘半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。

A=1/2h（W0.15＋W0.85）

式中W0.15和W0.85分别为峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽。③最佳方法--积分法

应用色谱工作站，即计算机及其相关软件对色谱峰进行积分。积分法自动化，速度快，计算准确，现在的色谱仪几乎都采用此法。

当色谱峰峰型好的时候，有时也采用峰高来进行定量计算（2）定量校正因子

①

定量校正因子

色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积。或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。因此，在计算时需将面积乘上一个换算系数，使组分的面积转换成相应物质的量，即

wi=fi′Ai式中Wi为组分i的量，它可以是质量，也可以是摩尔或体积（对气体）；Ai为峰面积，fi′为换算系数，称为定量校正因子。它可表示为

fi′=Wi/Ai定量校正因子定义为：单位峰面积的组分的量。检测器灵敏度Si与定量校正因子有以下关系式