液相色谱-故障分析和维护

液相色谱实用技术（一）使用注意事项及故障分析采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小流动相的选择液相色谱柱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长等等水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相的选择水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve鬼峰的出现流动相的选择溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱流动相的选择甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图流动相的选择滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和

有机溶剂溶剂的过滤流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰柱中气泡使流动相绕流，峰变形基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡检测器气泡脱气的目的防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测信号不稳定

1）示差折射率检测器：*使折射率变化

2）UV检测器（200nm以下）：*溶解氧气有吸收

3）荧光检测器：*溶解氧气有消光作用流动相脱气的方法加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机（氟树脂膜的减压脱气）可保持连续脱气，多用于低压梯度样品处理使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀· 装置：

高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱法优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度梯度洗脱法的注意点溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据。缓冲液

选择缓冲液的步骤

1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液

（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收

（在波长210nm附近进行检测时，

不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）缓冲液的使用

使用前必须过滤

使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞分离的简单原则出得来；分得开；尽量快。液相色谱常见问题

不要总是首先埋怨色谱柱!!!常见问题及其对策液相色谱常见问题类型

A.压力异常（偏高、波动）B.漏液C.保留时间漂移D.基线问题（漂移、噪声）E.峰形异常现象：无压力，流动相不流动可能原因

1、保险丝断或电源问题

2、柱塞杆折断

3、泵头内有空气或流动相不足

4、单向阀损坏

5、漏液

6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)压力异常现象：压力持续偏高或不断上升

1、流速设定过高

2、保护柱或柱子筛板堵塞

3、流动相使用不当或有缓冲盐析出

4、色谱柱选择不当

5、进样阀损坏

6、线路过滤器堵塞压力异常现象：压力持续偏低

1、流速设定过低

2、色谱柱选择不当

3、柱温过高

4、系统漏液压力异常压力异常现象：压力波动可能原因泵头中有气泡单向阀损坏柱塞密封圈损坏脱气不充分系统漏液使用了梯度洗脱漏液接头处漏液

1、接头处松动

2、接头磨损

3、接头被污染

4、部件不匹配

漏液泵漏液

1、单向阀松动

2、泵密封损坏

3、放空阀损坏

4、接头松动（不要拧的太紧）检测器漏液可能原因

1、流通池垫片损坏

2、流通池透镜破碎

3、手紧接头处漏液

4、进样针尺寸不合适

5、废液管堵塞

6、流通池堵塞漏液

可能原因

1、柱温变化

2、流动相组分变化

3、色谱柱没有平衡

4、流速变化

5、泵中有气泡

6、流动相选择不当

7、键合相流失

8、缓冲容量不够保留时间漂移基线漂移可能原因

1、温度波动

2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)3、流通池被污染或有气泡

4、流通池窗口破裂

5、流动相配比不当或流速变化

6、柱子平衡（约30－60min）基线问题基线漂移可能原因

7、流动相污染，变质或由低品质溶剂配成

8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出

9、检测器没有设定在最大吸收波长处基线问题基线噪声（规则的）可能原因

1、流动相、泵、检测器中有气泡

2、有地方漏液

3、流动相混和不均匀

4、温度影响（检测器和柱温差别太大）

5、其他电子设备的影响基线问题基线噪声（不规则的）可能原因

1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成

2、有地方漏液

3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀

4、流通池污染

5、检测池能量不足

6、系统内有气泡基线问题色谱峰分裂柱外死体积柱头填料污染部分阻塞进样阀密封问题化合物一起洗脱色谱峰展宽所有的色谱峰展宽柱效降低进样体积太大部分色谱峰展宽上次进样洗脱的色谱峰蛋白或聚合物等高分子量化合物色谱峰拖尾部分色谱峰拖尾次级保留效应–

残留硅醇基的作用在大峰的尾部有小峰所有色谱峰拖尾柱外效应柱头污染重金属离子色谱柱填充不理想前伸峰色谱柱没有充分平衡在主峰前有小色谱峰负峰检测器输出信号的极性相反样品的吸收小于流动相，流动相不纯样品溶剂干扰示差折光检测器中样品的折射率较低进样中带入气泡

可能原因

1、样品过载

2、样品溶剂选择不当变形峰鬼峰1、进样阀残余峰2、样品中未知物3、柱未平衡4、水污染5、三氟乙酸氧化液相色谱实用技术（二）色谱柱的使用及保养1.柱头螺丝2.过滤筛板3.色谱柱管刃环4.柱头压帽5.色谱柱柱管

色谱柱结构

3微米多孔二氧化硅微球固定相基质类型Si-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-H硅胶颗粒表面硅羟基键合相Si-O-HSi-O-SiSi-O-Si-O-SiSi-O-Si液相色谱固定相烷基键合固定相表面良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先仔细阅读说明书测定柱效（说明书+实际条件）保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作流动相的转换流速（压力）的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线过滤器In-LineFilter，部件号WAT084560防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）在色谱柱类型特殊时使用可更换的消耗品更换滤芯，部件号WAT005139(5/pkgs)更换垫圈，部件号WAT084567(10/pkgs)保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大Guard-Pak预装保护柱Waters的部件号，WAT088141有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低可换芯式保护柱新型的保护柱—SentryGuard适应的用户类型非常脏,非常复杂的样品本底生化样品,溶液环境样品食品不想做太多的固相萃取不想降低柱效新型的保护柱—SentryGuardSentryGuard的特点特点高质量,高效填料-不损失柱效增加分析柱效-增加适应范围20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)整体式（对Waters柱）-使用方便，容易各种不同填料配合Waters柱SentryGuard的规格产品描述3.920mm柱长适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换可换柱芯式设计，提供各种填料:BondaPak: C18,phenyl,CN,NH2,SilicaNova-Pak: C18,C8,phenyl,CN,SilicaResolve: C18,C8,SilicaDelta-Pak: C18,C4Symmetry: C18,C8色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐等等合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱储存固定相储存溶剂反相(C18,C8,C4,etc.)甲醇或乙腈Phenyl甲醇或乙腈

CN(反相)乙腈CN(正相)

3:97Heptane:IPA

NH2,Diol,Silica

3:97Heptane:IPA

色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异不同温度有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低柱压过高

为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大色谱柱与仪器的联接除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用“通用”型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从PhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。Waters色谱柱的联接Waters及PhaseSeparations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸Spherisorb品牌的色谱柱及PhaseSeparations公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090英寸HPLC常用的色谱柱接头TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)0.09in.=2.33mmSwagelok安捷伦1100液相ParkerValcoUptight0.09in.=2.33mm0.08in.=2.07mm0.09in.=2.33mm0.13in.=3.37mm0.17in.=4.40mmWatersRheodyne不同的Stop-Depth长度<0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中<2.1内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型HPLC中2