单克隆抗体的发展情况

©2006Accenture.Allrightsreserved.1Monoclonalantibodytechnology©2006Accenture.Allrightsreserved.2轻链（L）由约214个aminoacid组成，分两种：Kappa（κ）和Lambda（λ），重链由450-550个aminoacid组成，根据其抗原性差异可分为5种：μ链、γ链、α链、δ链和ε链。由此将免疫球蛋白分为M、G、A、D和E。©2006Accenture.Allrightsreserved.31抗体技术的发展单克隆抗体技术的发展第1代单抗技术：鼠源性单克隆抗体第2代单抗技术：嵌合性单克隆抗体第3代单抗技术：人源化单克隆抗体第4代单抗技术：全人源化单克隆抗体©2006Accenture.Allrightsreserved.41细胞工程单克隆抗体©2006Accenture.Allrightsreserved.52单链抗体（scFv）SOE法构建scFv基因产物VHVLVLVH变性、复性接头DNA，（Gly4Ser）3引物引物接头DNAPCR重叠延伸拼接法（SOE），是把Linker的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。scFv的优点是分子量小、免疫原性弱、渗透力强，并具有药物导向、中和毒素等功能，不需要进行糖基化修饰，可以在原核表达系统中进行表达。缺点是无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学活性。©2006Accenture.Allrightsreserved.63Fab抗体Fab抗体分子的制备PrVHVHVLCLCH1CH1VLCLS-S-H链表达载体L链表达载体共转染细胞抗体分泌细胞Fab片段是由H链Fd段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含有一个抗原结合位点，大小为完整抗体的1/3。可利用噬菌体构建表达有天然构象的Fab片段。Fab片段有中和毒素和病毒，封闭受体和药物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗体短的多。Pr©2006Accenture.Allrightsreserved.74抗体库技术抗体库按基因的来源可分为：鼠源性抗体库，人源性抗体库和驼源性抗体库

抗体库展示技术：噬菌体表面展示技术，酵母表面展示技术，核糖体展示技术抗体库技术的优点：1不需要进行细胞融合，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。2扩大了筛选容量，可达到106以上的克隆，而杂交瘤技术一般只能筛选约1000个克隆。3可直接克隆到抗体的基因，便于进一步构建各种基因工程抗体。4得到的抗体可以进行原核表达，降低制备成本。5构建抗体库时由于H链和L链V区基因在体外随机组合，因而可以获得新的特异性抗体。已有的噬菌体抗体库：抗HIV，麻疹病毒，破伤风类毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗体库。©2006Accenture.Allrightsreserved.8构建方法1动物免疫2血清效价检测3淋巴细胞的分离纯化4总RNA提取5第一链cDNA反转录合成6轻、重链基因的扩增7scFvDNA的组装与扩增8scFvDNA片段的SfiI/NotI酶切9pCANTAB5E–scFv重组质粒的构建10重组噬菌体的制备11库容量的滴定12单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选4.1噬菌体展示技术构建和筛选scFv图片来源：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司

©2006Accenture.Allrightsreserved.94.2噬菌体展示技术构建和筛选Fab抗体构建方法淋巴细胞分离、总RNA提取及cDNA的合成与scFv抗体库的构建相同1PCR扩增Fd及轻链基因2PCR扩增产物的纯化3轻链基因的克隆4重链Fd基因的克隆及噬菌体抗体库的建立和鉴定5Fd基因的克隆及抗体库的建立6抗体库的富集和筛选©2006Accenture.Allrightsreserved.104.3酵母表面展示技术酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术之后发展起来的真核展示系统，不仅能筛选噬菌体抗体库的全部抗体，而且能筛选新型抗体，是噬菌体抗体库筛选抗体的两倍。酵母存在MATa和MATα2种交配型单倍体细胞。酵母表面展示技术有两种：a凝集素展示系统是将目的蛋白的C端与a凝集素的Aga2亚基的N端融合；α凝集素展示系统是将目的蛋白的N端与α凝集素的C端融合。α凝激素展示系统原理图©2006Accenture.Allrightsreserved.115特殊基因工程抗体1.7.1双特异性抗体BsAb图片来源：武汉友芝友生物制药有限公司利用基因重组和抗体工程技术，由大容量抗体库的构建及优化系统，高通量抗体筛选系统，体内体外抗体验证系统三大部分组成，制备高效的肿瘤治疗性抗体，对乳腺癌，淋巴瘤和结肠癌进行针对性的治疗。细胞工程BsAb将2株分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞融合得到四源杂交瘤，就可以同时分泌具有两种亲代单克隆抗体结合特性的BsAb。其合成、组装与分泌过程和天然免疫球蛋白的产生过程相同，稳定性及药代动力学特征也与天然抗体相似。©2006Accenture.Allrightsreserved.126人鼠嵌合单克隆抗体为了消除人抗鼠抗体（HAMA）反应，使单抗更好的用于疾病治疗，人们设计了嵌合抗体。在基因水平上将鼠源单克隆抗体的V区和人抗体的C区连接起来，并在合适的宿主细胞中表达的抗体，成为人-鼠嵌合抗体。Pr鼠VL人CL人CH免疫球蛋白基因载体的构建L链嵌合载体共转染细胞抗体分泌细胞Pr鼠VHH链嵌合载体嵌合抗体的构建已上市销售的人鼠嵌合抗体：RituximabCD20抗肿瘤、类风湿CetuximabEGFRantagonist抗肿瘤Clotinab,abciximabGPⅡbⅢareceptor抗凝，心血管antagonistInfliximabTNF-αantagonist类风湿，克隆氏病等BasiliximabIL-2receptorantagonist抗移植排斥©2006Accenture.Allrightsreserved.13全人源化单抗人源化技术的难点在于它需要大量的学科集成，非常复杂，因为任何氨基酸改变都会影响蛋白质结构、活性，而这方面又没有太多规范可以遵循，因此需要大量的实践和探索。这是单抗药物研发的核心技术

，也是未来的发展方向。两个难点：一是抗体人源化技术，二是哺乳动物细胞规模化培养。

已上市的人源单抗：PanitumumabEGFRantagonist直肠癌AdalimumabTNFantagonist类风湿，克隆氏病等UstekinumabIL-12,IL-23antagonist银屑病7全人源化单克隆抗体全人源化单抗的两条技术路线：转基因小鼠技术，噬菌体展示技术©2006Accenture.Allrightsreserved.14转基因小鼠技术

目前主要是人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。hu-PBL-SCID转基因小鼠将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的淋巴细胞导入严重联合免疫缺陷（severecombinedimmunodeficiency，SCID）小鼠，作为暂时的人免疫系统发挥有限的功能。然后取鼠的脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交就可以获得分泌人抗体的杂交瘤细胞转染色体小鼠通过基因敲出技术使小鼠自身基因失活并导入新基因，创造出携带人抗体H、L链基因簇而自身抗体基因失活的转基因小鼠。此种小鼠所携带的人DNA片段具有完备的功能，可以有效的进行同种型转换和亲和力成熟。亲和力成熟：在抗原刺激下，抗体V区发生高频突变，具有高亲和力抗体的细胞群体获得优势而进一步扩增，同时经过类别转换，即不再表达μ链、δ链，而表达γ、α或ε而成熟。©2006Accenture.Allrightsreserved.152抗体的市场和应用单抗从最初的鼠源单抗过渡至人源化单抗直到现在的全人单抗,单克隆抗体的发展使抗体制备技术进入了一个全新的时代,其相关的药物已广泛应用到生物医学中的许多领域,如肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植、戒毒、血液性疾病、感染性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊断和治疗。目前美国和欧盟已批准上市抗体药物34个，全球有近300家公司正在研究抗体药物，其中，临床研究抗体项目有100多个，在研项目超过300个。我国已批准上市抗体药物18种，其中进口10种，国内企业获得抗体新药证书8个，实现销售4种，临床研究抗体药物13种。（截止到2012.12）

2011年全球抗体药物的市场规模为671亿美元。预计到2020年,生物技术药物占全部药品销售收入的比重将超过1/3。据全球医药市场预测机构EvaluatePharma对2012年销售前15位药品的估计,今年生物技术产品全面崛起,其中销售前十强中,单克隆抗体药物占据五席。名称阿达木单抗英利昔单抗利妥昔单抗曲妥珠单抗贝伐珠单抗排名14589国内商品名修美乐类克美罗华赫赛汀安维汀所属企业雅培强生、默沙东罗氏罗氏罗氏2011年销售额79亿美元81.6亿美元61.4亿美元53.5亿美元54.1亿美元预计2012年销售额94.8亿美元76.7亿美元69.4亿美元60.8亿美元59.8亿美元©2006Accenture.Allrightsreserved.16国内主要抗体公司成都华神集团股份有限公司制药厂华兰生物工程股份有限公司上海兰生股份有限公司北京天坛生物制品股份有限公司上海中信国建