细胞培养汇总

细胞培养一、无菌实验室二、常用的仪器设备三、细胞培养需要的物品四、细胞培养用液和培养基五、细胞培养基本技术一、无菌实验室组成：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与几个操作间相通。操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。二、实验室常用设备使用压力蒸汽消毒器1.使用前的准备：检查进气阀及排气阀是否关闭，并加入适量水。

2.装放灭菌物：然后加盖旋紧螺旋，密封。3.预热及排气：4.升压保温：一般为103.43kPa，温度则相当于121.3℃时，持续15～20min即可达到灭菌目的。5.降压开盖取物：关电源，待其压力下降至零时，方可开盖取物。【使用方法】干燥箱用于细胞培养的有些器械、器皿要烘干才能使用，玻璃器皿需干热消毒，因此，细胞培养实验室均配置有电热干燥箱。干热消毒时，升温较高，一般需达到160℃。水纯化装置进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水；即使用于玻璃器皿的冲洗，至少也应是二次蒸馏水。蒸馏水器、压力蒸气消毒器和电热干燥箱都是属于大功率电器，使用时一定要注意用电安全，尽量做到分开时间使用。超净工作台CO2培养箱培养箱：控温及的提供所需的CO2，使培养液的pH保持稳定。通常使用条件为37℃，5％CO2CO2供气凋节方法倒置显微镜离心机进行细胞培养时，常需要制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等，因此要使用离心机。平衡是关键电子分析天平冰箱细胞冷冻储存器1、冻细胞和组织2、注意液氮含量酸度计

酶标仪特殊设备如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，使实验室工作做得更有效、更精确、更深入。有关的特殊或先进设备如下：超低温冰箱，–70℃以下的冰箱便于储存有些试剂及标本；荧光显微镜，进行荧光染色样本的观察；更精确及快速检测细胞用的流式细胞仪等。三、细胞培养需要的物品：1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。2、蓝口瓶、离心管、吸管、冻存管、烧杯、量筒、饭盒、培养皿、封口膜3、枪头（TIP头）4、培养板，培养皿，细胞计数板5、手术器械。1、清洗2、浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液63∶1000∶200次强清洗液120∶200∶1000

弱清洁液100∶100∶1000需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净3、消毒物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小时过滤：0.22μm化学消毒灭菌法75%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素（主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染）四、细胞培养用液及培养基☆培养用液——水（三蒸水）平衡盐溶液（PBS）消化液☆培养基——天然培养基

合成培养基

配液前准备：①滤器、磁力搅拌器、烧杯、量筒、注射器。贮液瓶（生理盐水瓶）、0.15Mpa，121℃，30分钟蒸气灭菌②NaHCO3、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养基粉剂平衡盐液体（Balancedsaltsolution,BSS）组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分如：PBS、Hanks用途：用于洗涤组织、细胞或配制消化液时等配制：购买+高压消化液——分散组织、细胞作用：（1）在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。（2）在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。类型：组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。特点：1、胰蛋白酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1：125和1：250两种。2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的活力。消化细胞时，加入一些血清（10%）或含血清的培养液，能终止消化作用。胰蛋白酶液(Trypsin)称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许或PBS溶液调成糊状，再补足PBS，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，过滤除菌，分装入瓶中，-20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）。如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。胰蛋白酶溶液配制：

抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。

培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。一般市售市售链霉素为100万U/瓶培养基培养基——维持体外细胞生存和生长的溶液1、天然培养基2、合成培养基：合成培养基：RPMI1640，DMEM等。

一般需加血清等

市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制，配制时需要补加NaHCO3，调PH。配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3和谷氨酰胺。加抗生素：上述溶液配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22μm。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH四、灭活胎牛血清（FBS）与分装过程：1、一般外购的血清只作过灭菌，在用前常需进行灭活处理。2、热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清（加温到56℃，30min），以消除补体活性，未灭活血清应保存在–20℃冰箱。牛血清分装：在无菌的条件下一般分装成10ml一管，贮存于-20OC.使用时放置4OC冰箱过夜色解冻。五、细胞培养基本技术1、细胞原代培养2、细胞生长状况的观察3、细胞传代4、细胞冻存、复苏和运输5、细胞活力检测6、细胞周期检测7、细胞凋亡检测8、细胞凋亡的流式分析1、细胞原代培养原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。1、取材2、漂洗3、剪切4、消化5、过滤6、清洗7、计数8、接种2、细胞生长状况的观察培养细胞生长状况常规检查1、培养液：颜色与透明度的变化2、细胞生长状况。3、细胞形态变化。4、微生物污染。1、培养液PH值（颜色变化）变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长停滞、死亡。一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1次，生长慢的细胞需要3-4天换液一次。原代细胞换液通常每周两次，每次换半量或1/5-1/3量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。(2)细胞系(株)换液:条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。方法:2、细胞形态变化：生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。3、微生物污染：培养液颜色与透明度：培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。细胞培养的污染和检测细胞污染的种类细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之细胞

细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。白色念珠菌污染

真菌感染

支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状3、细胞传代（贴壁细胞）：1.吸光培养瓶中的培养液2.加入0.5-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），然后两种方式处理：一种30S后，吸去消化液，剩余的酶液继续作用，后在相差显微镜下观察。第二种，不吸去消化液，静置2-10min（显微镜下动态监测）。在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞变圆，相互之间不再连接成片.3.吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液(按顺序)。然后离心沉淀细胞。5.吸取1:2-5细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7.将后者放入培养箱中培养。4、细胞冻存、复苏和运输

冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法1、预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冷冻保存要点：冷冻过程要缓慢。4℃30－60分钟→-20℃30分钟→-80℃16－18小时（或过夜）→液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～~38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5-10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞运输：（1）长距离运输（几天）选择生长良好细胞，换细胞液，补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，瓶子口用胶密封，并用棉花包，放在携带者贴身口袋带回，或用包装盒空运。（2）短距离运输（几小时）去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥，将细胞附着面朝上带回。（3）液氮冻存运输5、细胞活力检测在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。应用：由组织中分离细胞复苏后的细胞药物筛选方法：细胞计数+台盼兰染色

MTT法（1）细胞计数

将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分钟。镜下观察计数细胞浓度的计算：Volume(体积)=長x寬x深度=1mmx1mmx0.1mm=0.1mm3=1x10-4cm3(ml)细胞密度(个/mL)=4个大方格的细胞总数/4

÷10-4=4个大方格的细胞总数/4

×104（2）台盼兰排斥染色原理：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见兰色的细胞，活细胞不被染色，呈透明状。步骤：制备单细胞悬液，并适当稀释（105/ml）9滴细胞悬液+1滴0.4%台盼兰染液，混匀染色。吸取少许悬液涂于计数板上。3分钟内计数活细胞和死细胞细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数

细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％(3)四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）：噻唑蓝原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。优点：简单快速、灵敏、经济应用:新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作流程：细胞接种96孔板（200ul，103-104/孔）贴壁后加处理因素加入MTT20ul（5mg/ml）,培养4h酶标仪检测0D值（波长490nm）吸出培养液，加入DMSO150ul,摇床震荡10min注意事项选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满种板技术：均匀实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物（一般5-7个梯度，设3-5个复孔）避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。边缘效应：周边孔加入PBS6、细胞周期检测流式细胞术PI染色细胞周期:细胞每一次分裂增殖的周期流式细胞术PI染色检测细胞周期原理：碘化丙锭（PI）可与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA酶将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以区分细胞周期各时相：G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间应用：通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖周期。

增加膜通透性消化RNA7、细胞凋亡的检测凋亡形态学特征●细胞体积变小，胞质浓缩。●胞膜结构完整，有泡状突起。●核染色质浓缩，聚集核膜周围。●细胞膜内陷形成凋亡小体(Apoptoticbodies)。●无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。

形态学鉴定细胞膜结构改变分析

胞膜通透性增加：改变细胞对一些核染料物质（DAPI、Hoechst、PI）的通透性，利用着色结果的差异区别检测坏死和凋亡细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）外翻到膜表面：

AnnexinV法常用方法有：DAPI、Hoechst、PI单染、Heochst/PI双染、Annexin-V/PI双染等。DAPIDAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区Hoechst染色Hoechst为膜通透性核酸染料，DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子能进入正常细胞，凋亡细胞的胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染凋亡细胞PI（PropidiumIodide,

碘化丙啶）是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红将Annexin-V、Heochst与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来Heochst/PI双染凋亡细胞膜通透性增高，Hoechst荧光（蓝色）强度增高PI不能进入细胞膜完整的活细胞中：正常细胞和凋亡细胞拒染，坏死细胞由于失去膜完整性可染（红色）。磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）在细胞凋亡的早期可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面Annexin-V是一种Ca2依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）或biotin标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。AnnexinV/PI双染色法8、细胞凋亡的流式分析利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞术（FlowCytometry，FCM）:流式细胞仪工作原理经荧光染色的细胞从喷嘴中高速喷出，通过一个聚焦的光源进而通过各种光敏元件测量这些细胞发射的散射光和荧光，经计算机处理得到多种信息参数信号检测--散射光前散射光（FSC)与细胞的大小有关侧散射光(SSC)反映细胞内的颗粒多少信号检测--荧光信号X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，与光强度之间线性关系或对数关系

Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率流式细胞仪检测细胞凋亡常用的三种方法

（一）PI单染色法（二）Heochst33342/PI双染色法（三）AnnexinV/PI双染色法PI单染色法Heochst33342/PI双染色法

凋亡细胞膜通透性增高，Hoechst33342荧光（蓝色）强度增高PI不能进入细胞膜完整的活细胞中：正常细胞和凋亡细胞拒染，坏死细胞由于膜完整性可染（红色）。

区别正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞：正常细胞：低蓝光/低红光凋亡细胞：高蓝光/低红光坏死细胞：高蓝光/高红光AnnexinV/PI双染色法

AnnexinV/PI双染色法左下象限:活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限:坏死细胞（FITC+/PI+）右下象限:凋亡细胞（FITC+/PI-）细胞培养常见问题解答：3、为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。

4、培养细胞生长减慢可能原因：由于更换不同培养液或血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验增加起始培养细胞浓度培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子