乙型病毒性肝炎的实验室检查讲座

我国HBV感染概况一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过

2000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；1~4岁组HBsAb阳性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb阳性率由1992年30.08%降至3.76%；12021/8/121HBV基因组HBVDNA是由长链L(负链)

和短链S(正链)

组成的不完全双链环状DNA，短链的长度相当于长链的50%～85%。HBVDNA长链载有病毒蛋白质的全部密码，有4个开放读码框架(ORF)，分别称为S、C、P和X区。编码7个蛋白质。HBVDNA易发生变异，特别是前S或S区基因较易突变。嗜肝DNA病毒的共同特点：内含3~3.3kb松散环状、部分双链DNA基因组及DNA聚合酶；病毒的复制需逆转录过程。32021/8/122HBV抗原和抗体系统表面抗原(HBsAg)：HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白

S蛋白：狭义的HBsAg指S蛋白。HBsAg阳性说明机体有HBV感染。中分子蛋白：preS2+S

大分子蛋白：preS1+preS2+SS蛋白中分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS2S1.HBsAg和抗-HBs2021/8/123e抗原(HBeAg)：是可溶性蛋白质只存在于血液中是病毒复制和传染性的标志e抗体(抗-HBe)：对HBV感染有一定的保护作用其出现标志着病毒复制减少、传染性降低前C区C区前C/C蛋白HBeAgHBcAg表达切割、加工HBeAg只存在于血清中HBVC基因分泌到细胞外2.HBeAg和抗-HBe52021/8/124HBV的三种形态1,HepatitisBvirion(Daneparticle)2,secretedfilament3,secretedsphere62021/8/1256HBV自然复制周期2021/8/1267生物化学检测1HBV血清标志物的检测2HBV分子生物学诊断3HBV临床药物疗效检测4HBV感染的实验室检查2021/8/1271.乙型肝炎的生物化学检测主要指标：ALT,AST,ASTm，血清白蛋白，血清胆红素，胆碱酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原时间(PT)及部分凝血因子；82021/8/128方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法(金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测；化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；可间接反映宿主HBV的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标Pre–S1、Pre–S2及其相应抗体对乙肝两对半的新认识92.HBV血清标志物检测2021/8/12910HBV血清标志物检测方法的成本效果分析(1)2021/8/121011HBV血清标志物检测方法的成本效果分析(2)Back2021/8/121112Terminal

proteinSpacerReverse

Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344preS1preS2Ss1s266HBsAg2021/8/1212XMutationofS&Pre-SS基因“a”决定簇

G145R

变异，与抗-HBs的亲和力降低S基因变异可导致隐匿性HBV感染(occultHBVinfection)，表现为血清HBsAg阴性，但仍可有HBV低水平复制(血清HBVDNA常<104拷贝/ml)献血员人群，隐匿性HBV感染的检出率可达0.19%142021/8/1213142021/8/121415Pre–S1检测的临床价值前S1蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上，在HBV感染宿主细胞过程及在病毒复制和刺激机体产生免疫反应中起重要作用;前S1抗原与HBeAg之间有高度相关性，并可区别因变异种及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假阴性，可作为HBeAg假阴性补充，从而准确反映患者体内病毒复制情况；可作为HBV感染及复制的标注，与其它血清标志物联合检测，相互补充。Back2021/8/121516大三阳小三阳vs2021/8/1216HBV血清学标志检测结果分析162021/8/121718类型HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb样本数(n)构成比(%)1＋－－－＋40.212＋－＋－＋231.203＋－－＋＋985.114－－－－＋462.405－－－＋＋683.556－＋－＋＋1849.607－＋－－＋633.298－＋－－－47024.539－－－－－96050.10合计1257172335048619161001916例HBV血清标志物阳性类型分布模式2021/8/1218192021/8/1219202021/8/122021HBVDNA定量检测病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关；主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。HBV基因分型基因分型的必要性；基因分型的主要方法；HBV耐药突变的检测3.HBV分子生物学诊断2021/8/1221慢性HBV感染治疗适应症的选择HBeAg阳性，HBVDNA载量>105copies/ml,ALT>2×ULN;HBeAg阴性，HBVDNA载量>104copies/ml,ALT>2×ULN;HBVDNA持续阳性，年龄>40岁，ALT大于正常上限，也可给予抗病毒治疗；HBVDNA持续阳性，年龄>40岁，ALT持续正常，应密切随访，动态观察疾病进展，必要时行肝组织检测，有病变证据时，可以给予抗病毒治疗；222021/8/1222HBV感染抗病毒治疗的疗效评估治疗终点：HBVDNA明显下降或低于检测下限，并伴有ALT正常；HBVDNA水平治疗开始后3个月内持续下降1log以上才说明治疗有效；每日0.5mg恩替卡韦治疗1年时,HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者HBVDNA检测不到率分别为67%和90%,恩替卡韦的HBeAg转换率为21%,与其他口服抗病毒药相似。并不以HBeAg转阴或HBsAg转阴为治疗终点或目标。232021/8/1223HBVDNA定量检测试剂盒的性能对比242021/8/122425同时可以实现对HCV,HIV-1,衣原体，及淋病的一体化检测Back2021/8/1225病毒基因突变疾病进展临床表现对干扰素应答耐药变异生化学改善HBeAg血清学转换HBVDNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝细胞癌(HCC)26HBV基因型/基因亚型2021/8/1226分型方法优缺点序列测定法最直接，最可信，是HBV基因分型的金标准，但繁琐费时而且价格昂贵，混合型检测能力差，不适于大样本检测。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。pre-S2单克隆抗体酶联免疫测定(mAbsEIA法)简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高并不能有效鉴别有些混合型感染和HBsAg低表达及某些表位表达不充分的标本。分子探针杂交法简单、快速，对混合型检测非常敏感，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高而且灵敏度和特异度还有待提高。型特异性引物PCR法简单、快速，成本低，具有较高的灵敏度，适于流行病学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。常用HBV基因分型方法比较272021/8/1227B型特异性“引物对”的特异度分析B型特异性引物HB（正义链）：5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’28Back2021/8/12284.HBV临床药物治疗监测乙肝病毒的耐药性检测，是精准治疗乙肝的关键！！目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过95%的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！拉米夫定是第一个被批准治疗慢性乙型肝炎的口服抗病毒药,已在全世界广泛应用。但其耐药发生率高,治疗1年时耐药发生率为23%,2年为46%,3年为55%,4和5年分别为65%和71%。292021/8/1229耐药---核苷(酸)类似物(NA)治疗失败最重要原因30拉米夫定LMV阿德福韦酯ADV替比夫定LdT恩替卡韦ETVHBV替诺福韦TDVNAs：抑制病毒复制长期使用耐药变异2021/8/1230临床耐药表型耐药基因耐药耐药研究312021/8/1231322021/8/123233PolymeraseTerminal

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Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344逆转录酶(RT)区某些位点变异与耐药相关preS1preS2HBsAgs1s266可同时分析：耐药变异，HBsAg变异，基因型，血清型2021/8/1233全长RT区分析技术路线HBVDNA提取snPCR扩增RT区PCR产物直接测序生物信息学