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文档简介

分子生物学实验

实验室守则实验要穿白大褂。实验室内禁止吃食物,勿高声谈话。实验前必须认真预习,熟悉实验的内容,了解所用的仪器用具;实验中应严格按操作规程进行,认真操作、仔细观察,及时记录实验现象及结果;实验结束后仔细地分析和总结实验结果,认真做好每一天的实验报告。使用贵重精密仪器时,应严格遵守操作规程,对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作(尤其是微量移液器!)。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师报告。在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里(或先放在自己的桌面废物缸内),严禁随地投弃!实验器具应保持清洁,例用过的玻璃器皿必须洗净后放回原处。实验台面应随时保持整洁,仪器、药品摆放整齐。公用试剂及用具盒用完后,应立即盖好放回原处。实验结束后要把微量移液器清点后归还,征得同意后方可离开实验实。实验时损坏的任何物品(尤其是微量移液器)都要按规定赔偿。执行值日生制度,每天安排3-4人值日,其职责是负责实验器具的整理、操作台、水槽、地板等实验室卫生工作和一切服务性工作,并注意实验室的水、电、门窗等方面情况。

分子生物学实验课程介绍

分子生物学实验是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学,是生物学专业教学计划中一门重要的实验课程。通过本课程的实践与操作,使学生全面、系统地掌握分子生物学实验的基本原理和技术,使学生了解分子生物学实验技术发展前沿,培养学生从分子水平上去分析、理解生命现象与过程,培养学生思考与探索生命的奥秘的能力。使理论知识与实践能力相辅相成,不断得到提升,培养学生严谨的科学态度与实事求是的作风。本课程的基本要求

掌握实验中涉及的有关的理论知识常用技术的原理实验中使用的试剂的作用实验可能达到的预期结果掌握有关的实验操作常用器具、仪器的使用方法和注意事项常用技术的实验步骤及其原理具备基本的实验方案设计能力实验参考书:实验指导书;《分子克隆》;卢圣栋《现代分子生物学技术》;

魏群《分子生物写实验指导》(北师大)本课程涉及的基因技术基因克隆:通过PCR分离外源DNA/基因序列→外源DNA/基因序列和克隆/表达载体的酶切→DNA片段的连接(外源DNA/基因与载体的连接)→重组分子转入到宿主细胞内(以扩增或表达外源基因)基因组DNA提取质粒/载体DNA的提取DNA/RNA的检测:琼脂糖凝胶电泳检测、紫外分光光度计的检测实验1:移液器的使用实验2:聚合酶链式反应(λDNA的PCR)扩增(只做PCR,不做检测)实验3:基因组DNA的提取(CTAB法提取植物基因组DNA)(由只提取DNA,不做检测)实验4:琼脂糖凝胶电泳(实验2、3的检测,完成实验报告1、2)实验5:质粒DNA的提取(不做检测)实验6:质粒DNA浓度和纯度检测(完成实验报告3)实验7:质粒DNA的酶切、连接及凝胶电泳检测(实验报告4)实验8:大肠杆菌感受态细胞的制备与转化(实验报告5)实验内容及时间安排分子生物学实验

注意事项“安全”观念:使用离心机要注意离心样品的平衡。微波炉内不可使用金属容器、空载容器、密闭容器。使用电泳仪等电器时注意用电安全。使用灭菌锅、温箱时注意压力、温度不可超过最大限值。使用紫外线时,注意防护:不可裸眼注视,不可在紫外线下暴晒……实验时带一次性手套、穿白大褂。使用可能造成环境污染或对人体等生物体有害的物品,在实验结束后要集中处理,不可随处丢弃。“污染”观念:保持干净,防止污染凡是实验操作所用的一切塑料器具(EP管、tip等)及可以进行灭菌的试剂都必须在使用前装入盒子和瓶子中经过灭菌(高压蒸汽灭菌、过滤灭菌)后进行使用,以防止杂质的污染及其对实验样品DNA、RNA或蛋白质的降解。实验带上一次性手套,手套用完后捆好再弃于废物缸。手持离心管时注意不要触碰离心管的内表面,包括盖子内表面。每吸取一种试剂都要更换

tip头,要避免试剂间交叉污染。每次取用tip头后盒盖关上。管内表面盖内表面外表面“小心”观念:仔细、认真操作实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容物收集至管底后再进行下步的实验。实验过程中应做好每个样品的标记工作,且一般在离心管上用记号笔作标记时,应在两处重复做好标记。尤其注意:微量移液器的使用其它:实验前应做好试剂的配置,用品灭菌等准备工作,配置分子生物学实验各种试剂,必须要使用重蒸水(ddH2O)。使用后的器皿必须认真清洁干净,洗完后还要用重蒸水冲洗三次。微量移液器的使用微量移液器是连续可调的,用于计量和转移液体的专用仪器,其装有直接读数的容量计。排放旋钮读数窗量程(可调读数范围)可脱卸吸嘴(枪头、吸头、tip头)卸尖按钮卸尖器我们实验室的微量移液器共有四种规格,在移液器量程范围内能连续调节读数。分别是:0.5~10μl(读数窗显示0.5~10.0,精度为0.1μl)5~50μl(读数窗显示5.0~50.0,精度为0.5μl)20~200μl(读数窗显示20~200,精度为1μl)100~1000μl(读数窗显示100~1000,精度为5μl)量液的操作步骤第一步:容量设定切记:读数窗的读数绝对不能超出量程范围!!!顺时针调节→读数变大;逆时针调节→读数变小正确的容量设定分为两个步骤:一是粗调,即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值;二是细调,当容量值接近自己的预想值以后,应将移液器横置,水平放至自己的眼前,通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值,从而避免视觉误差所造成的影响。注意:当我们从大值调整到小值时,刚好就行;但从小值调整到大值时,就需要调超三分之一圈后再返回,这是因为计数器里面有一定的空隙,需要弥补。第二步:安装吸头旋转安装法安装吸头将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上轻轻用力向下压(A),同时把手中的移液器按逆时针方向旋转180°(B),使吸头紧紧地扣在枪嘴上。AB注意:不同规格的移液器使用不同规格的吸头。切记用力不能过猛,更不能采取锤、跺吸头的方法来进行安装,因为那样做会对您手中的移液器造成不必要的损伤。吸头要紧密扣在吸嘴上,不可漏气,否则导致吸液不精确。(漏气的检验:吸液后垂直移液器,在吸头出现液体渗出甚至液滴滴漏,即表明吸头与吸嘴吻合不严而漏气。)将微量移液器按钮轻轻压至第一停点;垂直握持微量移液器,使tip头浸入液面下几毫米,千万不要将tip头直接插到液体底部;缓慢、平稳地松开控制按钮,吸上液体,稍等片刻后将tip头提离液面。第三步:吸液关于吸液的特别注意:

严禁吸液后将移液器平放!吸液时一定要缓慢松开排放旋钮使液体进入吸头,否则,液体会迅速进入tip头,导致液体(尤其是一些腐蚀性液体,如氯仿)倒冲入移液器内部,对移液器造成损伤,同时也可能造成溶液的污染。对于粘稠液体可首先吸放几次,然后极缓慢地松开按钮,使溶液慢慢进入吸头内;否则,可使吸入体积减少。第四步:放液平稳地把按钮压到第一停点,再把按钮压至第二停点以排出剩余液体;提起微量移液器,使tip头在容器壁擦过;按tip头卸尖器卸下tip头。放液的注意事项:如果将要将一种溶液放到另一种溶液中时,最好将吸头插入叶面下后再放液;放液时容易产生气泡,在进行下一步反应前可瞬时离心将气泡赶走。放液量液操作注意问题未装tip头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。一定要在允许量程范围内设定容量,千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围,否则会造成损坏。不要横放带有残余液体tip头的移液器。为了避免量液误差,不要用大量程的移液器移取小体积样品。在几种规格都能一次完成取液时尽量选取精确度高的(量程小的)。所取的体积有精度要求时,需根据各规格的量程和精度来配合完成取液。练习使用移液枪进行移液:量取下列容量的蒸馏水并转移到另一个管子中:1、0.5μl2、3.5μl3、10μl4、17.4μl5、89.5μl6、250μl7、800μl8、0.3μl液体A+0.3μl液体B,转移到同一个管子中9、45μl10、将0.5μl液体A转移到盛有10μl液体B的管子中实验二、

聚合酶链式反应扩增

λDNA特异片段实验目的及要求掌握:技术原理PCR扩增技术的原理技术操作熟练使用微量移液器吸放微量液体PCR体系建立的基本操作聚合酶链式反应的基本原理什么是聚合酶链式反应(PCR)?

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是模拟DNA的复制过程,在体外特异性扩增DNA片段的方法,从而获得大量的同一序列DNA。细胞内的DNA复制|细胞分裂

(体内的DNA扩增)Step1.解链Step2.引物结合Step3.子链延伸DNA复制的模板DNA聚合酶RNA引物4种脱氧核糖核酸(dNTP)聚合酶链式反应(PCR)(体外的DNA扩增)Step1.解链Step2.引物结合Step3.子链延伸DNA复制的模板DNA聚合酶RNA引物4种脱氧核糖核酸(dNTP)DNA复制的模板耐热的TaqDNA聚合酶DNA引物4种脱氧核糖核酸(dNTP)PCR缓冲液(含Mg2+等提供适当的反应条件)Step1.高温模板变性Step2.低温引物与模板退火Step3.中温子链延伸反应体系:反应程序(过程)PCR扩增过程

温度持续时间94℃(预变性)4min94℃(变性)30sec52℃(退火)30sec72℃(延伸)1min72℃(补充延伸)5minDNA模板变性退火:引物+模板新链延伸37~55℃72℃N次循环引物耐热的DNA聚合酶30次循环模板DNA94℃94℃~95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间(min)温度(℃)适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA94℃变性94℃~95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点ReverseprimerForwardPrimerDNA引物50℃复性55℃(视具体情况而定)PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点ReversePrimerForwardPrimerDNA引物Taq酶Taq酶72℃延伸72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点94℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点94℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理论产物拷贝数=2nn循环次数实际产物拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

为什么可以通过PCR扩增得到特异片段?特异片段1st

循环2nd

循环3rd

循环4th

循环5th

循环继续:扩增特异片段PCR的特点灵敏度高理论上1~3个DNA分子经PCR扩增可获得百万以上个相同的DNA分子特异性强扩增的产物与模板分子特异区域完全相同简便、快速一次性加好反应液,1~3小时完成扩增,扩增产物一般用电泳方法即可检测分析对标本的要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等的粗提DNAPCR的应用研究基因克隆,DNA测序,分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测,肿瘤检测和诊断法医犯罪现场标本分析;亲缘关系鉴定其他……实验材料与试剂1、DNA模板:λDNA(30ng/μl)2、4种dNTP混和物3、10×PCR反应缓冲液(15mmol/LMgCl2、500mmol/LKCl、100mmol/Ltris.HCl(pH8.3)、0.1%明胶)4、引物1和引物2:见“实验指导”6、TaqDNA聚合酶(贮存液:50%甘油,100mmol/LKCl,20mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mmol/LEDTA,1.0mmol/LDTT)7、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物(100bpDNAMarker)(下次电泳检测实验用)PCR的基本步骤1、PCR反应体系的建立(1)取0.2ml的薄壁离心管,按表1顺序加入试剂.(2)稍混匀,短暂离心把溶液甩至管底。试剂标记成份体积(μl)H2OddH2O17.25B10×反应缓冲液2.5ddNTPs(2.5mMeach)21引物112引物21PλDNA(30ng/μl)1TTaqDNA聚合酶0.25总体积25表1PCR反应体系2、设置PCR的变温程序(热循环反应)(1)按表2设置PCR反应的变温程序。(2)把离心管放进PCR仪进行扩增。(3)反应结束后低温保存或检测。反应阶段循环数

温度持续时间1194℃(预变性)3min23094℃(变性)30sec55℃(退火)30sec72℃(延伸)1min3172℃(补充延伸)10min4(可选)116℃(冷却)4℃冰箱:短时间保存;-20℃:长期保存表2PCR反应的变温程序3、PCR扩增产物的检测取10μl产物进行电泳检测(操作步骤:实验4)1:DNAMarkerDL2,0002~5:PCR扩增产物(500bp片段)本实验的预期结果:PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测2000100075050020010012345实验报告(做完实验4后完成)记录PCR扩增DNA以及DNAMarker的电泳图谱,说明带型含义(对结果和出现的问题进行分析,如若未获得单一的扩增带,这是什么原因造成的?扩增带颜色深浅说明什么等)必做课外思考题:一位同学从拟南芥中提取了RNA并在体外逆转录获得了cDNA。他打算以该cDNA为模板,从中将下列基因的编码区序列(红色字体部分,长561bp)通过PCR反应扩增出来。已知cDNA模板的浓度为0.5μg/μl,引物母液浓度为10μM,TaqDNA聚合酶母液浓度为

5U/μl,PCR缓冲液为

10×浓度的母液.请帮助他(1)设计合适的引物,(2)建立适当的反应体系和(3)扩增程序以扩增红色部分的序列。CGAGAAAAGGAAAAAAAAAAATAGAAAGAGAAAACGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAACCCAAACCTGAGGATCAAATTAGGGCACAAAGCCCTCTCGGAGAGAAGCCATGGGAAGAAAAAAACTAGAAATCAAGCGAATTGAGAACAAAAGTAGCCGACAAGTCACCTTCTCCAAACGTCGCAACGGTCTCATCGAGAAAGCTCGTCAGCTTTCTGTTCTCTGTGACGCATCCGTCGCTCTTCTCGTCGTCTCCGCCTCCGGCAAGCTCTACAGCTTCTCCTCCGGCGATAACCTGGTCAAGATCCTTGATCGATATGGGAAACAGCATGCTGATGATCTTAAAGCCTTGGATCATCAGTCAAAAGCTCTGAACTATGGTTCACACTATGAGCTACTTGAACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGGGATCAAATGTCAAAAATGTGAGTATCGATGCTCTTGTTCAACTGGAGGAACACCTTGAGACTGCCCTCTCCGTGACTAGAGCCAAGAAGACCGAACTCATGTTGAAGCTTGTTGAGAATCTTAAAGAAAAGGAGAAAATGCTGAAAGAAGAGAACCAGGTTTTGGCTAGCCAGGTTTGGATCCGAGTGGCTCAGTTCCAACTCCAAGTGTCTAGAAGTAGTGCTACTTTTACATGCTATATATAGATGGAGAATAATCATCATGTGGGAGCAGAAGCTGAGATGGAGATGTCACCTGCTGGACAAATCTCCGACAATCTTCCGGTGACTCTCCCACTACTTAATTAGCCACCTTAAATCGGCGGTTGAAATCAAAATCCAAAACATATATAATTATGAAGAAAAAAAAAATAAGATATGTAATTATTCCGCTGATAAGGGCGAGCGTTTGTATATCTTAATACTCTCTCTTTGGCCAAGAGACTTTGTGTGTGATACTTAAGTAGACGGAACTAAGTCAATACTATCTGTTTTAAGACAAAAGGTTGATGAACTTTGTACCTTATTCGTGTGAG植物基因组DNA的抽提实验三实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。2.了解基因组DNA的实验用途。3.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。实验原理(CTAB法)CTAB,十六烷基三甲基溴化铵,是一种阳离子去污剂,可使细胞破裂,释放出核酸;CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl,有助于溶解释放出来的DNA(DNA在2mol/LNaCl中DNA具有较高的溶解度);加入无水乙醇,可以使DNA从溶液中沉淀出来。材料:花椰菜设备:移液器,高速离心机,水浴锅,培养箱

。试剂:2%CTAB抽提缓冲液2.氯仿/异戊醇(24:1)3.无水乙醇4.70%乙醇5.TE或ddH2OCTAB溶液配制2%CTAB抽提缓冲液:100mmol/LTris-HCl,pH7.0;1.4mol/LNaCl;20mmol/LEDTA;2%CTAB.

10mlfinalconc.(终浓度)CTAB0.2g2%sterilemilli-QH2O5.78ml

1MTRIS-HCl1.0ml100mM5MNaCl2.8ml1.4M0.5MEDTA0.4ml20mM实验步骤(常温操作,2人一组)取适量植物组织,加入2mlCTAB抽提缓冲液,充分匀浆2-3min,然后转移800ul的匀浆液至一支2ml离心管中,65℃水浴45min(裂解细胞,释放核酸和蛋白);加入800ul的氯仿/异戊醇),上下摇动2-3min(此步是萃取组织液中的蛋白质;务必带上手套!);12000g离心10min,取600ul上清液转移至一支2.0ml离心管中(由于此时悬液已经分层,而我们需要取最上层的溶液,所以注意千万不要使枪头触碰到中间的杂质层,当然,更不能取吸取下层的萃取液了);加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)(60ul),上下颠倒混匀;然后再加入2倍体积的无水乙醇(1.2ml),上下颠倒混匀(此时可见大量絮状物出现,即DNA);12000g离心10min,去掉上清液,取沉淀(即DNA);加入适量70%乙醇清洗DNA(目的是清洗DNA表面携带的盐离子等物质)。如果DNA已经悬浮,就稍加离心,然后去掉清液;打开离心管盖,在室温下晾干1min(注意干燥程度,要以管壁上无水珠而DNA表面有些湿润最佳,尽量不要让DNA干燥的太厉害,以免影响溶解);加入50-100ulTE(含50ug/mlRNase),轻弹管底,以溶解DNA(如溶解度不佳,可65度水浴10分钟助溶)。将溶解的DNA储存于-20度冰箱中(以备下次实验课电泳检测)。核酸的贮存——DNA保存1)短期贮存:4℃或-20℃存放于TE(Tris和EDTA)缓冲液中。

TE缓冲液(PH为8.0),可减少DNA脱氨反应;EDTA可以抑制DNase的活性。2)长期贮存:

TE缓冲液中-70℃保存数年;无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离子,作用是中和核酸分子表面的负电荷,减少分子间的排斥力,有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水,使DNA沉淀析出,基因组DNA提取的用途构建基因组文库Southern杂交RFLP基因克隆(PCR)DNA的琼脂糖凝胶电泳检测实验四实验原理在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。根据核酸的估计分子量大小、分辨率的要求、核酸的种类来选择电泳的支持基质。聚丙烯胺凝胶分辨率高,可分离差异仅有1bp的DNA;配制麻烦琼脂糖凝胶中等分辨高,常用于分离中等大小的分子;分辨率取决于琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,琼脂糖分子之间相互交联成网络结构;主要利用DNA分子在电场中的泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到分离混合物的目的。由于DNA链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加,所以实际上DNA分子的荷质比始终是一个常数,因此荷质比(电荷效应)不影响电泳迁移率。在恒电场的一定电场强度下,DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比500bpMarker~800bp~600bp阴极阳极相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率也不同质粒DNA的分子构型(a)松弛线性的DNA(L)(b)松弛开环(OC)(c)超螺旋(cccDNA)三种构型的质粒的电泳模式图谱不同螺旋程度的DNA的电泳泳动率的差异1、琼脂糖2、TBE缓冲液:临用时用水稀至0.5×TBE(10倍稀释);pH8.0~8.23、核酸电泳的指示剂溴酚兰:在碱性液体中呈紫蓝色二甲苯青:在碱性液体中呈蓝色琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%溴酚兰的迁移率:与之相当的DNA大小1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%二甲苯青迁移率:与之相当的DNA大小2Kb1.6Kb在电泳中,溴酚兰和二甲苯青的迁移率与下列双链线性DNA片段相当:试剂4、载样缓冲液(LoadingBuffer)(成分:蔗糖、甘油或聚蔗糖400+电泳指示剂)增加样品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色,使加样操作更方便5、荧光染料GoldView(GV)

是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同,在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µlGoldView即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光,而单链DNA呈现红色荧光。GoldView不仅能染DNA,也可用于染RNA。

分子量标准Marker

购买的商品化的DNA分子量Marker是一个DNA分子混合物,内含大小不同但分子量确定的DNA分子,在电泳时分离开来成为梯状电泳图谱。

其中一个分子量的DNA往往是有确切的含量的。可根据这个分子的电泳条带的亮度估算待测DNA的含量。30ng/μlPCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶的制备根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度;胶板的准备:胶槽置于水平支持物上(两侧封口),插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙;注意:每个小组1块制备8孔的琼脂糖凝胶。胶液的制备:称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入20ml0.5×

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