鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用 医疗临床医学专业

鸭坦布苏病毒病防治关键技术研究及应用Keytechnologyresearchandapplicationofducktembusuvirusdiseasecontrol目录TOC\o"1-4"\h\u9950摘要 V20088Abstract VI23500缩略词表 I19484第一章综述 210801鸭坦布苏病毒病 227982病原学 2192292.1生物学分类 2105672.2形态结构及理化培养特性 280863鸭坦布苏病毒病的主要流行病学特征 28834江西省蛋鸭场鸭坦布苏病毒病流行概况 3225095鸭坦布苏病毒诊断方法 474215.1临床诊断 4323255.2实验室诊断方法 485015.2.1病原检测 470385.2.2免疫组化方法 574295.2.3间接免疫突光试验 5149115.2.4酶联免疫吸附试验 625680第二章研究的目的及意义 727470第三章材料与方法 8264831材料 875761.1实验动物及病料来源 886071.2主要试剂 8285711.3菌株与细胞 8202551.4常用试剂及缓冲液配制 833521.5主要仪器 8212011.6分析软件及说明 98072病原分离鉴定实验 9113492.1样品采集 915782.1.1样品背景调查 9114552.1.2样品采集 10164412.2病原分离 10178702.2.1病毒提取分离 10133002.2.2引物设计 10286682.2.3病毒RNA提取及第一链合成 11242922.2.4全基因扩增与克隆 11178872.3基因测序 11245203病毒复制试验 12101583.1病毒增殖培养 12185713.2病毒含量测定 1240813.3实验分组及攻毒 12165713.4攻毒效果评价 12191014病毒传播途径探究试验 1311894.1病毒增殖培养 1326094.2实验分组及方法 13283074.3实验效果评价 13293225鸭坦布苏病毒防治试验 13252785.1毒株、疫苗来源 13121695.2中草药配制 13317195.3实验分组及方法 1476185.4实验效果评价 1414706流行病学调查及田间应用试验 15322066.1调查与应用试验范围 15316176.2开展方式 15120196.3实验效果评价 1513422第四章实验结果 1651791病原分离鉴定实验 16299591.1PCR结果 1679971.2序列比对结果 1749202病毒复制试验 1856622.1临床结果 1932912.2PCR检测结果 1957723病毒传播途径探究试验 19110553.1临床结果 1996813.2病理剖检结果 20254074鸭坦布苏病毒防治试验 21241024.1试验后产蛋变化结果 21251674.2致死率结果 21283494.3剖检病理变化结果 22249605流行病学调查及田间应用试验 24186935.1流调结果 24242495.2田间应用结果 25219586结论与讨论 2612630参考文献 2824818致谢 32摘要鸭坦布苏病毒病（DuckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋大幅下降为主要特征的急性、烈性传染病。自2010年4月起，鸭坦布苏病毒病（DTMUVD）在我国部分地区相继暴发，在江西、安徽、河南、福建、广东、河北、山东、江苏、浙江、广西等地部分鸭场均有过报道，该病病程约为1～2个月，会引起蛋鸭产蛋大幅下降，耐过的种鸭群可逐渐恢复产蛋，但淘汰率一般在10%～30%之间，给养鸭业造成了严重的经济损失[1-6]。近些年以来，该病的发病率虽然出现降低趋势，但是仍然存在高效防治措施不多、疫病暴发的原因尚未明确、动物回归的试验开展难度较大、疫病传播的途径不够详实等问题，为该病防控带来了巨大的挑战。本文旨在运用我省自主分离纯化的流行毒株进行病毒复制试验及防治研究，确定我省蛋鸭减蛋症致病原因，系统运用中草药制剂对当前鸭坦布苏病毒病防治效果进行研究，确定最优防治鸭坦布苏病毒病的药物组方，获得药效学和安全性分析基础数据，以期为开展好该病的防控提供科学性的建议与指导。研究的具体结果包括：一、鸭坦布苏病毒病病原学、生物学特性研究1.通过病毒复制实验，结果证明实验成功复制鸭坦布苏病毒病，经病毒分离、基因序列测定分析表明，其病原为黄病毒科黄病毒属的坦布苏病；鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且是独立的病毒种类，具有可复制性，且在感染机体内能够稳定存在。2.通过鸭坦布苏病毒病传播实验，结果证明鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性，且能够通过混群接触感染、空气传播等方式进行传播，在日常生产过程中对患病鸭群应尽早实行较好的隔离措施等方式，才能阻止疫病的传播。二、鸭坦布苏病毒病临床研究3.通过鸭坦布苏病毒过预防用药与攻毒实验，结果证明本试验所选用F疫苗和中草药1组、2组配方均能很好地控制鸭坦布苏病毒对鸭群产蛋的危害，能够显著地增强鸭群抵抗力，减轻卵巢的损伤，缩短恢复产蛋的时间；但是中草药1组配方在治疗时没能很好的控制蛋鸭死亡，鸭群死亡率为3.33%。疫苗是预防该病发生与防控的较好选择，中草药在预防该病防控与治疗中有一定效果，但用法、用量及生产效益比等仍需进一步深入研究。关键词：鸭坦布苏病毒病，中草药，生物学特性，疫病传播，疫病防控AbstractDucktembusuvirusdisease(DTMUVD)isanacuteandstronginfectiousdiseasecausedbyDuckTembusuvirus(DTMUV).SinceApril2010,templeSueducktembusuvirusdisease(DTMUVD)outbreaksinpartsofourcountryandinjiangxi,anhui,henan,fujian,guangdong,hebei,shandong,jiangsu,zhejiang,guangxiandotherplacesofYaChangwerereported,andthediseasecourseofabout1~2months,canleadtoasignificantdeclineineggproductionpathogenies,resistanttothekindsofduckscangraduallyrestoretheeggs,butselective,generallybetween10%~30%,suppliesseriescausedseriouseconomiclosses[1-6].Inrecentyears,althoughtheincidenceofthediseaseappearedtoreducethetrend,buttherearestillfeweffectivepreventionandcontrolmeasures,thecauseofthediseaseoutbreakisnotyetclear,animalregressiontestisdifficult,thespreadoftheepidemicapproachessuchproblemsasinsufficient,broughtahugechallengeforthediseasecontrolandprevention.Thepurposeofthispaperistouseourprovinceautonomouspurificationofpandemicstrainforpreventionandcontrolofviralreplicationtestandresearch,determinethepathogenieseggdiseasecausesreductioninourprovince,thesystemuseofChineseherbalmedicinepreparationforthecurrentducktempleSuevirusdiseasepreventionandcontroleffectarestudied,determiningtheoptimaldrugpreventionandcontrolofducktempleSuevirusdiseasecharacteristics,basisofpharmacodynamicsandsafetyanalysisdata,inordertocarryoutwellthepreventionandcontrolofthediseasetoprovidescientificadviceandguidance.Specificresultsofthestudyinclude:1.Studyontheetiologyandbiologicalcharacteristicsofducktambusuvirusdisease.1.ThroughtheviralreplicationexperimentresultsshowthattheexperimentsuccessfullycopiedducktempleSuevirusdisease,afterthevirusseparation,determinationofgenesequenceanalysisshowedthatthepathogenofyellowvirusflavivirusgenustempleSuedisease;Itisnotonlypathogenic,butalsoindependentvirusspecies,whichisreproducibleandcanbestableintheinfectedorganism.2.ThroughthetempleSueduckviraldiseasetransmissionexperiment,theresultsshowthattheducktempleSuenotonlyhasthepathogenicvirusdisease,infection,andcanbemixedgroupofcontactintheformofairandspread,indailyproductionprocessforsickducksgoodisolationmeasuresshallcomeintoforceassoonaspossible,topreventthespreadofthedisease.Ii.Clinicalstudyofducktembusuvirusdisease.3.ThroughtheducktempleSueviruspreventiondrugandpoisonattackexperiment,theresultsprovethatthisexperimentchoosesFvaccineandChineseherbalmedicineformula1group,2groupwerewellcontrolledducktempleSuevirusduckstotheharmofeggproduction,cansignificantlyenhanceducksresistance,reduceovarianlesions,shortentherecoverytimeofegg;However,theformulaof1groupofChineseherbalmedicinefailedtocontrolthedeathoftheduck,andthedeathratewas3.33%.Vaccineisagoodchoiceforpreventionofthediseaseoccurrenceandpreventionandcontrol,Chineseherbalmedicineinthepreventionofthediseasecontrolandpreventionandtreatmenthasacertaineffect,buttheusage,dosageandtheproductionefficiencyratiostillneedsfurtherresearch.Keywords:ducktembusuvirusdisease,Chineseherbalmedicine,biologicalcharacteristics,epidemicdiseasetransmission,epidemicpreventionandcontrol.缩略词表AbbreviationsTable英文缩写英文全称中文名称minhSMLbpkDaELISAMinuteHourSecondMilliliterBasepairKilodaltonEnzyme-linkedimMunosorbentassay分钟小时秒毫升碱基对千道尔顿酶联免疫吸附试验DTMUVDuckTembusuvirus鸭坦布苏病毒IHCImmuno-Histochemistry免疫组织化学DTMUVDDuckTembusuvirusdisease鸭坦布苏病毒病第一章综述1鸭坦布苏病毒病鸭坦布苏病毒病（DuckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一种急性、烈性传染病，以蛋鸭产蛋大幅下降为主要特征的。该病的流行特点表现为发病急、传播速度快、发病率高等，会导致蛋鸭产蛋迅速下降甚至停产。发病前期主要表现为持续高热，发病鸭群后期会出现一定比例的神经症状，临床表现为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调。该病发病率可高达100%，但病死率较低，约为5～15％[1-6]。2病原学2.1生物学分类在分类学上，鸭坦布苏病毒(DTMUV)归属于黄病毒科（Flaviviridae）的黄病毒属（Flavivirus）中恩塔亚病毒群（Ntayavirusgroup）的坦布苏病毒（Tembusuvirus）[7-8]。2.2形态结构及理化培养特性鸭坦布苏病毒（DTMUV）具有典型的黄病毒形态特征，病毒粒子呈现球形状，表面有纤突和囊膜，直径约为50nm。该病毒不耐热，对乙醚和氯仿较为敏感[9]；该病毒不具备血凝活性，无法凝集鸡、鸭、鹅、鹤、人、鼠、猪、兔等的红细胞。鸭坦布该苏病毒（DTMUV）增殖载体较多，在鸭胚、鸡胚、Vero细胞和鸭胚成纤维细胞中均可以增殖，主要在感染细胞的胞浆内复制[10]。鸭坦布该苏病毒经尿囊腔接种鸭胚3～5d后死亡，表现为绒毛尿囊膜增厚、水肿，胚体水肿、出血，表现为折光性增强，细胞变圆及融合，最终崩解死亡[11-13]。2.3基因结构鸭坦布苏病毒（DTMUV）具有黄病毒典型的基因组特征，是单股正链的RNA病毒，有衣壳。病毒基因组全长10,990nt，基因组顺序为5'-UTR-C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5-UTR-3'。开放阅读框为10278nt，5'端及3'端的非编码区长度分别为94nt和618nt[28-32]。外膜蛋白E上连续7个氨基酸的抗原区域主要集中在20-400位氨基酸，分别为：E25-33，E52-74，E79-88，E118-127，E148-161，E166-174，E178-186，E215-230，E243-252，E261-270，E285-292，E313-319，E351-357，E388-398。在E蛋白的103-105位和154-156位存在两个糖基化位点（分别为NGC和NYS）[34-43]。3鸭坦布苏病毒病的主要流行病学特征黄病毒属大多数病毒危害较大，是一种可引起脑炎、脊髓炎、明显的神经症状的人畜共患、自然疫源性疾病的病毒，比如登革热病毒、脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒等[9,33]。鸭坦布苏病毒（DTMUV）也不例外，站立不稳，卧地不起等神经症状在鸭感染后该病毒都均有表现，但除此之外，该病毒与其他黄病毒属病毒不同的是地方还表现于该病毒可致蛋鸭卵巢病变，从而导致产蛋下降[14-20]。DTMUV几乎可感染所有品种的鸭，尤其是对麻鸭的致病力最强，易感染群主要以产蛋鸭群为主，现也有在鸡]、种鹅]和野鸭体内也分离到该病毒的报道，可见其致病范围之广[21-29]。本病的流行病学的确切研究目前尚未看见报道，但从临床角度来看，如果鸭舍中一栏鸭发病后，疫病扩展到整栋鸭舍时间只需要1-2天内，同一地区的其他鸭场一周之内即可蔓延到达[13]，通过开展动物实验来验证，与病鸭同居可感染发病，由此推断出，水平传播为该病毒的主要传播方式，尤其是经过呼吸道的传播，动物的采食及饮水也有可能传播该病[6,14]。因为黄病毒属大部分成员的传播方式为蚊虫传播，所以DTMUV经虫媒传播的可能性也存在。但根据有关数据显示，在北方地区在秋冬季节，蚊虫活动相对较少，但仍然有DTMUVD大面积的流行的情况，而且白蛉和蚊虫的飞行距离较为有限，这与该疫情可以在短时间内大范围暴发的情况不大相符。目前尚无蚊子体内病毒的分离和动物回归试验报道，且病毒传播期间的温度变化与其他节肢动物传播的其他黄病毒的发病时间也不一致，所以目前该病毒不一定是以节肢动物为主要传播媒介，一些鸟类也有可能是传播媒介[9,15]。赵冬敏等[16]发现该病毒在种鹅中可通过鹅胚传到下一代，说明该病毒可经垂直传播。4江西省蛋鸭场鸭坦布苏病毒病流行概况在上世纪90年代，就有DTMUVD发生的报道，1997年，一种疑似黄病毒的有囊膜病毒被温立斌等[17]从石家庄、邢台等地出现产蛋下降、神经症状的康贝尔鸭子中分离到，初步命名为“鸭病毒性脑炎”。从2010年开始，仅仅几个月的时间，该病就在我国突然大规模爆发，席卷了我国绝大多数养鸭地区。随后，相继报道了种鸭和蛋鸭产蛋下降的病例，并从病例中分离到一种黄病毒。从发病种鸭中分离出了一种新型黄病毒，命名为BYD病毒。起初，该病有多种命名，鸭病毒性脑炎、鸭出血性卵巢炎、鸭黄病毒感染、如鸭产蛋下降综合症、鸭坦布苏病毒感染等均被使用过。经过大量的研究发现，导致鸭群发病的这种黄病毒在进化关系上，与1955年从马来西亚库蚊中分离到的坦布苏病毒非常相近[19]。因此，该病名称于2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将统一，命名为“鸭坦布苏病毒病”。2010年，DTMUVD被报道传入江西省，给江西省养鸭业造成了巨大经济损失。自2015年9月份以来，江西省大多数蛋鸭养殖集中区相继出现产蛋鸭产蛋率突然大幅下降的情况，该疫病在乐平市、鄱阳县、弋阳县、新建区、丰城市、宜丰县等地均有爆发。通过对发病群体的临床症状、剖检观察、病毒分离、基因测序和动物回归试验等技术手段，确定了该病的致病原因是DTMUV[19]。2016年3～5月，笔者对江西省蛋鸭养殖密集区进行了大量调查，先后到九江、吉安、南昌、鹰潭、景德镇等5个地市的20个养殖场（其中包括了3个发病场），共采集血清和棉拭子样品524份，对采集的样品进行荧光定量RT-PCR检测。通过实地调查和实验室检测，结果显示鸭坦布苏病毒感染率较高，鸭坦布苏病毒感染在3个发病场（其中包括1个鹅发病场）均被检测出；20个被调查的养殖场中，有18个场检测出DTMUV阳性，养殖场带毒率高达90%。5鸭坦布苏病毒诊断方法5.1临床诊断产蛋鸭感染DTMUV的主要临床表现为釆食量大幅下降，严重时甚至出现食欲废绝现象，产蛋率亦随之急剧下降，可由产蛋高峰期的90%～95%在短期内下降至5%～10%。该病的发病率高达100%，而且感染后该病的死淘率达到了5%～15%，继发感染时鸭群死淘率可达30%[40-44]。流行初期病鸭会出现体温升高、排绿色稀粪的临床症状，后期神经症状表现更加明显，会出现头颈抽搐、共济失调的情况，双腿向后伸展，甚至瘫痪，严重病鸭会导致死亡。病鸭所产种蛋受精率会受到较大影响，受精率会降低10%左右。该病病程一般为1～1.5个月，可自行逐渐恢复[45]。体质好的鸭群，尤其是刚开产或产蛋高峰期的鸭群，产蛋率一般可以恢复到发病前的产蛋水平。蛋鸭在感染该病后，恢复后期多数会出现一个明显的换羽过程。商品肉鸭和育成期的种鸭发病后临床症状表现以神经症状为主，表现站立不稳、倒地不起、行走不稳，发病期一般在20～40日龄，病鸭有饮欲和食欲，但多数会出现饮水、釆食困难的情况，因此病鸭容易因进水进食困难而衰竭死亡，死淘率为10%～30%[45-47]。5.2实验室诊断方法5.2.1病原检测5.2.1.1电镜法在实验室诊断方式中，一般可根据病毒本身具有的形态、结构和大小等不同的特征，利用电镜技术进行直观、准确地病毒鉴别，此诊断方法较为直观。用DTMUV感染DF-1细胞72h后，2.5％戊二酵固定，制作超薄的病理切片，通过电镜观察，发现该病毒有球形、有囊膜、有纤突的病毒粒子，病毒粒子直径大约50nm[47-50]。该方法虽然能直观地观察到病原体，但需要专业技术人员才能操作，操作步骤也比较繁琐，且该检测法对病毒量有较高的要求，所以不能用于快速诊断。5.2.1.2病毒分离病毒分离接种法经常用于分离检测活的病毒，是一种较为传统且经典的病毒检测技术。感染DTMUV的病鸭适宜分离病毒的部位有卵泡膜、脑、脾脏、肝脏等病变组织，其中最易分离和检测到病毒的是卵泡膜和卵巢中。DTMUV在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中初次分离的成功率仅为20.6％，低于临床样品RT-PCR检出率[46-52]。乳鼠脑内接种法和细胞接种分离法是病毒分离常用的两种方法，将病料研磨处理后，乳鼠脑内接种一定数量的DTMUV，观察散窝、弓背、震颤、抽搐、甚至死亡等情况是否会在乳鼠身上出现，以此来判断其是否感染。同时，可以根据发病鼠数量测定病毒的滴度。细胞接种分离法，受限于有的黄病毒产生的细胞病变不明显，难以区别和判断，所以分离阳性率低。在实际操作中，接种分离法经常免疫组织化学、免疫焚光、焚光定量RT-PCR等方法结使用，以此来相互印证，一般不单独应用。无论是乳鼠脑内接种法还是细胞接种分离法，均有实验周期长，操作繁琐等缺点，特别是当结果为阴性时，需要进行盲传代，以排除由于病毒量少而导致假阴性结果的可能性[53-69]。5.2.2免疫组化方法免疫组织化学（Immuno-histochemistry,IHC）又称免疫细胞化学,简称免疫组化，IHC是组织化学的分支，其是在组织化学的基础上逐渐发展起来的。为了实现对细胞或组织内的相应抗原进行定性、定位或定量检测的目的，需要借助突光或细胞化学的手段，以抗体作为特异性染色的载体，将一些物质标记在抗体分子上，使抗原抗体复合物能够在显微镜下直接观察，其原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点。随着免疫组织化学技术的出现和发展，传统的病理学也发生了一场翻天覆地的革命，使得纯形态的病理学逐渐发展成为了现代病理学，它包括了形态与免疫信号两部分。对鸭群进行人工鸭坦布苏病毒攻毒后，取攻毒感染鸭的主要组织脏器，制作切片后进行免疫组织化学分析，结果在肾脏、脑、脾脏、肺脏等器官中均有黄色棕染颗粒，而明显的阳性信号在对照组中没有发现，这表明，鸭坦布苏病毒存在于这些组织脏器中[20,21]。5.2.3间接免疫突光试验间接免疫突光试验是病毒感染快速诊断的一个重要手段，简便、特异性强、非特异性的突光染色少是间接免疫突光试验的最大优点。间接免疫突光试验利用的基本原理是将突光素与某些特异性抗体或抗原以共价键结合，但共价键的结合不影响该抗体的特异性，然后用此突光素标记的抗体对标本染色，只要标本中有相应的抗原，则突光标记的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，在紫外光或激